Los autores quisieran expresar muchas gracias a los Dres. Josep Planas y Juan Castillo por su experiencia profesional en el desarrollo y aplicación de este protocolo de cultivo de pequeños peces y anfibios. Se agradece también a las innumerables personas que han colaborado incansablemente con la disección y la disociación del tejido muscular de muchos peces (tanto en las especies y número), entre ellos Mateo carga, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily y Sinibaldo Romero. Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Alabama en el Departamento de Biología fondos iniciales Birmingham, Centro para la Investigación de la proteasa NIH Grant # 2P20 RR015566, NIH NIAMS Grant # R03AR055350 y NDSU Avance ADELANTE NSF Grant # HRD-0811239 al PRB. El apoyo también fue proporcionado por el Centro de Investigación de la UAB Nutrición Obesidad premio # P30DK056336, NIH NIDDK. Sus contenidos son de exclusiva responsabilidad de sus autores y no necesariamenterepresentar los puntos de vista oficiales de la NIH.

Declaración de Ética: Todo experimentación con animales vertebrados se describen en el presente documento fue aprobado previamente por el Comité de la Universidad de Alabama en Birmingham Institucional Cuidado de Animales y el uso y está en consonancia con las directrices establecidas por la Oficina de Laboratorio Animal Welfare, Institutos Nacionales de Salud de los EE.UU. Departamento de Salud y Servicios Humanos. 1. Preparación para la Cultura <ol><li> Preparar el medio de base de la siguiente manera: 9 mM de NaHCO3 (1,51 g por 2 L), HEPES 20 mM (9,53 g por 2 L) en DMEM (13,48 g / L; 26,96 g por 2 L). <ol><li> Determinar el pH y ajustar a 7,40 con HCl o NaOH. </li><li> Determinar la osmolalidad y ajustar a ~ 300 mOsm con NaCl (si es necesario). </li><li> Filtro de esterilizar usando (2) sistemas de esterilización 1 L de vacío y se almacenan a 4 ° C protegido de la luz para un máximo de 2-3 meses. NOTA: Consulte las tablas 1 y 2 para el reactivo completa, herramientas, consumbles, y la información del equipo. </li></ol></li><li> Preparar poli-L-lisina-tratada placas por disolución de 5 mg de γ-irradiado poli-L-lisina (&gt; 300.000 MW) en 50 ml de agua ultrapura estéril. Mezclar suavemente por inversión durante 10 minutos a temperatura ambiente, asegurando la plena disolución de polímeros de lisina. </li><li> Pipetear la cantidad necesaria de solución de poli-L-lisina en cada pocillo, según el tipo de placa (Tabla 3). Permitir placas en reposo en campana de flujo laminar durante 5 minutos. </li><li> A continuación, eliminar la solución de poli-L-lisina y se lava dos veces con agua estéril. Permitir platos se sequen al aire en la campana de flujo laminar durante 20 minutos. </li><li> Obtener 1 mg de laminina (origen de Engelbreth-Holm-Swarm) y disolver en 50 ml de medio base a una concentración final de 20 mg / ml. Aplique una solución de laminina para placas de cultivo celular de poli-L-lisina tratados en 2 mg / cm 2. (Véase la Tabla 3 para diferentes tamaños de placa) </li><li> Remover con suavidad la solución para garantizar full y cobertura. Sellar las placas con cinta de laboratorio y colocar en la incubadora durante 24 horas. La incubadora debe ajustarse a la temperatura adecuada para las especies que se utilizan (véase el cuadro 7), y no hay gases adicionales deben agregarse a la incubadora. NOTA: La laminina se debe permitir que se adhieran a las placas durante 24 horas antes de la siembra de células. El no hacerlo resultará en malas o ninguna adherencia de las células. </li><li> Preparar los medios de comunicación como se describe en la Tabla 4. Medios de comunicación completa se prepara mejor el día de uso. </li><li> En preparación para el aislamiento de los tejidos, juntad a los siguientes artículos y autoclave: 300-500 vaso (s) ml; platos de Petri de vidrio; bisturí maneja; fórceps (fino y grueso); tijeras de disección; y varias hojas de papel autoclave de repelente de agua. NOTA: Por cada persona que ayuda con el proceso de disección, (2) los mangos de bisturí, (1) pinzas (tipo dependiendo de la preferencia personal), (1) tijeras de disección, y (5-10) hojas de papel autoclave repelente al agua sonsuficiente. </li><li> Además de los elementos tratados en autoclave anteriores, montar etanol al 70%, el equilibrio de peso, tubos cónicos de 50 ml estériles (el número depende del tamaño de la cultura), y el hielo. </li></ol> 2. Disección de tejido <ol><li> Antes de empezar, asegúrese de que una población suficiente de pescado disponible. NOTA: La edad de los peces que se utilizará es de importancia crítica. Mientras que los peces de dos especies diferentes pueden ser de un peso similar, un pez más joven de una especie poseerá más PSM que un pez mayor de otra especie. Como regla general, los peces más jóvenes, sobre todo cuando se trabaja con los salmónidos, son los mejores. Para danionins, peces tan viejos hasta un año se puede utilizar de manera óptima, mientras que los salmónidos de edad de 4-6 meses de edad o menos (hasta 15 g) son óptimos. </li><li> Para cada 5 g de tejido a ser disecado, alícuota de 25 ml de medio de aislamiento en un tubo cónico de 50 ml estéril. </li><li> Pesar, masa de grabación, y el número del tubo (s). Coloque los tubos en hielo. </li><li> La eutanasia a los peces 2-3a la vez por inmersión en&gt; 300 mg / L de bicarbonato de sodio tamponada con tricaína metanosulfonato. Permitir movimiento opercular cesar durante&gt; 5 minutos y luego sumergir los peces en etanol al 70% (contenido en los recipientes estériles) durante 30 segundos. </li><li> Retire el pescado de etanol al 70% y colocar sobre papel autoclave repelente al agua. Directamente detrás de los opérculos, utiliza un bisturí para hacer una incisión superficial y poco profundo. Quite las escamas y la piel sujetando la piel en la incisión antes mencionado y tirar hacia la cola de pescado. </li><li> Después de la eliminación de la piel, cortar el epaxial, rápido-glucolítica muscular &quot;blanca&quot; de los peces de ambas partes (evitando el músculo lento oxidativo &#39;roja&#39; se encuentra cerca de la línea lateral) y el lugar en medio de aislamiento. Desechar el resto de los peces como es requerido por la institución. Células Aunque es perfectamente posible PSM cultura procedentes de músculo rojo, casi cada publicación mediante teleósteos PSM ha utilizado aislados del m epaxial: NOTAyotome. </li><li> Repetir los pasos 2.4 a 2.6 hasta que se obtiene una cantidad suficiente de músculo. Durante la disección, asegurar que el tejido muscular agrupada permanece en hielo para mantener la viabilidad celular. </li></ol> 3. Disociación mecánica <ol><li> Vierta un tubo de 25 ml / 5 g de tejido muscular en una placa de Petri de vidrio. Usando dos bisturí maneja con adjuntos # 10 hojas de bisturí, tejido picada a una suspensión o puré de consistencia. Una moción &quot;ida y vuelta&quot; de tirar las hojas de bisturí más allá de uno que funciona mejor. NOTA: Si bien homogeneizadores de tejidos pueden parecer apropiado, el número de células viables se reduce dramáticamente, si no abolida. </li><li> Usando una pipeta serológica de 25 ml y pipeta serológica, eliminar el tejido se suspendió y reemplazar en el tubo cónico originales. </li><li> Repetir los pasos 3.1 a 3.2 hasta que todo el tejido en todos los tubos se ha disociado mecánicamente. </li><li> Tejido Centrifugar durante 5 minutos a 300 x g y 10 º C. </li><li> Folldebido centrifugación, desechar los 25 ml de sobrenadante de medios con una pipeta de 25 ml serológica, aspirador de vacío, o mediante una cuidadosa decantación. </li><li> Añadir 25 ml de medio de lavado a cada tejido de las trompas, resuspender y centrifugar como anteriormente. </li><li> Lavar dos veces con medio de lavado, eliminar el sobrenadante cada vez. </li></ol> 4. Disociación enzimática <ol><li> Durante el paso 3.4, preparar la solución de colagenasa combinando 0,22 g de colagenasa tipo IV y 44 ml de medio de base (o la cantidad suficiente a 0,11 g/0.22 ml). </li><li> Mezcle en un vaso de precipitados durante 10-15 minutos a 4 ° C. Filtro de esterilizar con una jeringa de 50 ml y un filtro de jeringa de 0,45 micras. NOTA: Es posible que se necesite más de un filtro de jeringa, dependiendo de la preparación de colagenasa. La colagenasa obtenidos de proveedores distintos de Worthington Biochemical plantea más dificultades durante la filtración. La colagenasa se utiliza para disociar los enlaces peptídicos en el colágeno que constituye el endomisio. Estedigestión eliminará la barrera protectora de las fibras musculares. </li><li> Por cada gramo de tejido muscular, tejido resuspender en una solución de colagenasa 0,2%. Para 5 g de tejido muscular, añadir 10 ml de solución de colagenasa y 15 ml de medio base. </li><li> Añadir 10 l de FDP por ml de solución del medio de colagenasa / base (por ejemplo 250 l a 25 ml). Asegúrese de que el tejido está bien suspendido, ya que esto puede afectar a la eficiencia de la digestión enzimática. </li><li> Incubar el tejido muscular en la colagenasa durante 60 minutos a 18 ° C con agitación suave. Dependiendo del grado de disociación y especies mecánica, digestión con colagenasa puede extenderse a 90 minutos, aunque esto puede afectar la viabilidad celular. </li><li> Después de tubos de digestión colagenasa, cónicas centrifugar a 300 xg durante 5 minutos a 12 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender el tejido en 25 ml de medio de lavado. </li><li> Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 126; C. Repita con el medio de lavado por segunda vez. </li><li> Después de lavar dos veces el tejido, el tejido muscular se vuelve a suspender en 25 ml de medio de lavado y se tritura con una pipeta serológica de 10 ml hasta que el tejido / homogeneizado medio pasa dentro y fuera de la pipeta con relativa facilidad. 5-10 trituraciones suele ser suficiente. <ol><li> Repita con una pipeta serológica de 5 ml y luego una cánula de metal de calibre 16 unida a una jeringa. </li></ol></li><li> Tubos de centrífuga cónicos a 300 xg durante 5 minutos a 12 ° C. Decantar el sobrenadante. </li><li> Durante la centrifugación por encima de 5 minutos, preparar la solución de digestión con tripsina mediante la combinación de 0,25 g de tripsina con 5 ml de medio base. </li><li> Se agita a 4 ° C durante 10-15 minutos y esterilizar por filtración con una jeringa de 20 ml y 0,45 micras filtro de jeringa. </li><li> Recuperar tubos cónicos y añadir 100 ml de solución de tripsina y 4,9 ml de medio de disociación para cada 1 g de tejido muscular a cada tubo. Para example, añadir 500 l de solución de tripsina y 24,5 ml de medio de disociación a 5 g de tejido muscular. NOTA: La tripsina es una proteasa serina que separar células precursoras miogénicas de la lámina basal. </li><li> Resuspender el tejido en el tripsina / pocillo de medio de disociación. Incubar durante 20 minutos a 18 ° C. </li><li> Después de la primera incubación con tripsina, tubos cónicos de centrífuga a 300 xg durante 1 min a 12 ° C. </li><li> Neutralizar la tripsina mediante la combinación de los sobrenadantes con medio de aislamiento a una concentración de 1 volumen de sobrenadante a 4 volúmenes de medio de aislamiento. Almacenar a 4 ° C durante la segunda digestión con tripsina. </li><li> Para el sedimento restante de tejido, repita los pasos 4.12 a 4.15, combinando el sobrenadante después de la etapa de 4,15 con el medio sobrenadante / aislamiento de la primera digestión con tripsina. </li><li> Alternativa: Las digestiones de colagenasa y tripsina se pueden combinar para maximizar los rendimientos celulares. &lt;ol&gt; <li> Para hacer esto, tritura el colagenasa digerir usando una cánula de metal (6 en longitud y el calibre 16 que funciona mejor) unido a una jeringa de 20 ml hasta que el homogeneizado pasa fácilmente a través de la cánula. </li><li> Para el homogeneizado, añadir 500 l de solución de tripsina (preparado en el paso 4,10) y se incuba a 18 ° C durante 20 minutos. </li><li> Siguiendo los tubos de incubación, cónicas centrifugar a 300 xg durante 1 minuto a 12 ° C. </li><li> Neutralizar la tripsina mediante la combinación de los sobrenadantes con medio de aislamiento a una concentración de 1 volumen de sobrenadante a 4 volúmenes de medio de aislamiento. </li><li> Almacenar a 4 ° C durante la segunda digestión con tripsina. </li><li> Continúe con el punto 4.18 al igual que con el protocolo estándar. </li></ol></li><li> Vierta la mezcla de medio sobrenadante / aislamiento final en tubos de 50 ml cónicos y centrifugar a 300 xg durante 10 minutos a 12 ° C. </li><li> Retirar los sobrenadantes teniendo cuidado de no alterar la célulapellets. Pipetear 2 ml de medio completo en cada tubo, disolución cada sedimento celular. </li><li> Combinar las células en suspensión en medio completo en un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Enjuague con cada tubo 1 ml de medio completo, con la combinación de la piscina de células resuspendidas previamente. </li><li> Se tritura con una cánula de metal y jeringa 5-10 veces. </li><li> Filtrar la suspensión celular a través de un filtro de 100 micras de células, aclarando con medio completo. </li><li> Se filtra la suspensión celular a través de un filtro de células de 40 micras. </li><li> Añadir medio completo suficiente para 50 ml y centrifugar a 300 xg durante 10 minutos a 15 ° C. </li></ol> 5. Contar, dilución y siembra de células <ol><li> Después de la centrifugación final en el paso 4,25, eliminar el sobrenadante por decantación o cuidado con una pipeta serológica. Resuspender el sedimento de células en 5 ml de medio completo. </li><li> Con las células se volvieron a suspender totalmente, retire 20 l; De la suspensión celular y colocar en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Añadir 5 l de colorante azul de tripano y espere 5 minutos. El uso de un hemocitómetro, determinar el número de células viables. </li><li> Tras la determinación, diluir las células a la concentración necesaria. Teleost PSM están mejor sembró a 150.000-200.000 células por cm 2. Para que una estrategia de seis pocillos chapado, diluyendo las células de 1,5 x 10 6 - 2,0 x 10 6 por ml apoya la proliferación y diferenciación suficiente. </li><li> Recuperar poli-L-lisina tratados, placas recubiertas con laminina y células de semillas. (Véase la Tabla 5 para las diluciones de placa específica y volúmenes de galvanoplastia.) NOTA: Tabla 6 representa el número promedio de células aisladas por gramo de tejido muscular aislado a partir de diversas especies de teleósteos. Trucha arco iris (O. mykiss) presentan un menor número de países socios mediterráneos por gramo de tejido muscular que hacer el pez cebra (D. rerio) y por lo tanto requieren más pescado para aislar a partir de la siembra adecuada. </li><li> Sellar las placas con cinta de laboratorio y colocar en la incubadora de enfriamiento a la temperatura adecuada. PSM de todas las especies incluidas aquí (salvo para los ratones) pueden incubar en condiciones atmosféricas normales, sin dióxido de carbono (CO 2) de la suplementación. (Véase el cuadro 7.) </li><li> ALTERNATIVA: Algunos laboratorios han adoptado un protocolo que pide permitiendo PSM a adherirse a los sustratos de cultivo durante 40 minutos. <ol><li> Luego enjuague placas con medio de lavado para eliminar las células poco adheridas y no adheridas. Advertencia: Este paso es muy importante para evitar la adhesión &quot;no específica&quot; de otras células (fibroblastos) de los sustratos de cultivo. </li><li> Añadir medio completo y las células de lugar en la incubadora y cuidar como se detalla a continuación. </li></ol></li></ol>

No hay nada que revelar.

El programa miogénica, en el que las especies examinadas, se puede estudiar más fácilmente a través de un sistema in vitro. De hecho, después del aislamiento, las células precursoras miogénicas (PSM) en el pescado o células myosatellite (MSC) en mamíferos entran fácilmente este proceso altamente regulado que implica la proliferación, la retirada del ciclo celular, y la diferenciación terminal de los mioblastos y la fusión de los mioblastos en miotubos nacientes. La falta general de cepas transgéni...

Entendimiento considerable de miogénesis mamíferos se ha obtenido a través de la recapitulación de este proceso en los dos cultivos de mioblastos de ratón primario (Mus musculus) y la línea celular derivada de ratón bien descrito, C2C12 5. A partir de la década de 1950 6, estas culturas han dado lugar a mucho progreso en la comprensión del programa murinemyogenic y, por extensión, la miogénesis en otros vertebrados. Además, una sola célula de las técnicas de miofibras de explantes han aumentado a cabo comprensión de las interacciones entre las células satélite y miofibras que rodean 7-9. Los cultivos celulares son particularmente atractivos para las investigaciones de la miogénesis debido al corto tiempo de precursor de célula diferenciada 10, relativa facilidad de la transfección para ARNi 11-14, transgénico 15,16 y sobreexpresión estudios 14,17,18, la expansión in vitro seguida de trasplante in vivo 18-20, e incluso un borradorarison de células precursoras miogénicas y sus agentes reguladores de todo taxa 21,22. Mientras que las diferencias debido a la ambiente artificial del sistema de cultivo han sido descritos 5,23, estos sistemas in vitro han demostrado ser indispensable para nuestra disección del programa intrincada que rige la formación de multinucleadas, myofibersfrom diferenciación terminal mononucleadas células progenitoras proliferativas conocidas como myosatellite células (MSC) entre los mamíferos. Fuera de la clase de los mamíferos, sin embargo, la conservación y / o divergencia de los mecanismos que controlan la miogénesis, son poco conocidos, en gran parte debido a la dificultad en el cultivo de células precursoras miogénicas (PSM) y mioblastos de varios taxones. De hecho, cultivos de mioblastos primarios sólo se han descrito en tres aves 24-26, un reptil 27, un par de anfibios 28-30, y algunos peces 1,3,4,31-33. Continuas líneas de células miogénicas de VErtebrates distintas de roedores 34-36 son aún más raros, con la única línea que no sean mamíferos miogénica de células que se deriva de la codorniz japonesa (Cortunix japonica), QM7 37. A pesar de muchos intentos de inmortalización, una línea celular miogénica teleósteos sigue siendo difícil de alcanzar y un protocolo para la transfección eficiente de estas células sólo se publicó este año 15. Por lo tanto, los protocolos claros y bien optimizados para el cultivo de los PSM primarias y mioblastos a partir de una variedad de vertebrados son muy necesarias, no sólo para ampliar aún más nuestro conocimiento de la evolución del programa miogénico, pero para emplear el poder de la fisiología comparada a hacer avances en el tratamiento de enfermedades del músculo esquelético y trastornos humanos. Mientras que la literatura contiene muchos informes de aislamiento MPC / mioblastos 38-49, es común que los autores describen los protocolos para estos aislamientos en breves, a menudo incompletos, formatos. Además, los protocolos más instructivas reportorted se han desarrollado para los ratones 50-53, y algunos de ellos dependen de la selección de anticuerpos 54,55 o 56,57 transgenes de fluorescencia, por lo que estos protocolos inutilizable o especie no roedora más íntimos poco prácticos utilizados por los biólogos musculares. Con poco conocido sobre piscine, anfibios y reptiles miogénesis, un protocolo detallado y minucioso, que se describe con la guía audiovisual y con una eficacia demostrada en especies alejadas, sería más útil para el campo. Descrita por primera vez por Powell y sus colegas en 1989 58, el siguiente protocolo fue desarrollado inicialmente para aislar PSM y mioblastos de salmónidos (a saber, la trucha arco iris, Oncorhynchus mykiss, y el salmón del Atlántico, Salmo salar) y algunos ciprínidos grandes (es decir, peces de colores, Carassiusauratusauratus) . En 2000, Fauconneau y Paboeuf optimizan una cultura de mioblastos primarios para la trucha arco iris 59 y minoroptimizations made ese protocolo utilizable en varios pececillos pequeños del clado Danioninae (pez cebra, Danio rerio, y danio gigante, Devario aequipinnatus) 32 debido a las muchas herramientas genéticas disponibles para el trabajo de pez cebra y por lo tanto sus familiares cercanos. Peces teleósteos son organismos atractivos para el estudio debido a su estrategia de crecimiento divergente (al menos en la mayoría de las especies). Las grandes salmónidos, como la mayoría de los peces, crecen indeterminadamente, con potencial de crecimiento sin restricciones de una asíntota en la madurez, incluso en edad 60-62 años. A diferencia de pez cebra, grandes danionins como el danio gigante 63 y potenciales de crecimiento display danio bigotudos típicas de los peces teleósteos, por lo que su yuxtaposición directa en una plataforma ideal para la comprensión de si la elección del destino celular MPC juega un papel en la hiperplasia del músculo esquelético en comparación con la hipertrofia. Asimismo, hemos demostrado que este protocolo se puede utilizar con ratones y ajolotes, con rendimiento relativamente alto de células y VIABíndices LIDAD. Salamandras urodele, como el ajolote mexicano (Ambystomamexicanum), poseen la notable capacidad de regenerar los tejidos, incluyendo las extremidades y la cola 64-66 enteras. Esta característica hace que estos anfibios interesantes modelos de pérdida de músculo esquelético y el envejecimiento. Utilizando el protocolo descrito a continuación, un enfoque similar puede llevarse a cabo como se ha hecho en muchas especies de peces, proporcionando un contexto comparativo aún más amplia para tales estudios. Como muchos biólogos verdaderamente aprecian comparativos, los avances más significativos en la biología básica y la biomedicina traslacional se pueden hacer cuando se analizan los datos dentro del más amplio espectro (en este caso, todo el linaje de vertebrados).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Detailed Reagent Information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:205px;">Reagent</td>
			<td style="width:217px;">Company (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:160px;">Catalog Number (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:161px;">Quantity per Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">&#947;-irradiated poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)</td>
			<td>P5899 (ICN19454405)</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DMEM (high glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (cellgro)</td>
			<td>MT-50-003-PB (D7777)</td>
			<td>2 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Laminin</td>
			<td>BD Biosciences (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>CB-40232 (L2020)</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="41" style="height:41px;width:205px;">Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP328-500 (S5761)</td>
			<td>1.51 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">HEPES (C8H18N2O4S)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP310-1 (H6147)</td>
			<td>9.53 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SV3007901 (A5955)</td>
			<td>17-20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Lonza (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BW17-519Z (G1397)</td>
			<td>2-3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Donor Equine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007403 (H1270)</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Fetal Bovine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007103 (F2442)</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Collagenase (Type IV)</td>
			<td>Worthington (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>LS004189 (C9891)</td>
			<td>0.44 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Trypsin (from Pancreas)</td>
			<td>MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>ICN15357125 (T5266)</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Consumables, Tools and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:239px;">Consumable</td>
			<td style="width:204px;">Tools</td>
			<td style="width:199px;">Equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;">Cell Culture Plates</td>
			<td>Forceps (Coarse)</td>
			<td>Serological Pipettor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Sterile 50 mL Conical Tubes</td>
			<td style="width:204px;">Forceps (Fine)</td>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Laboratory Tape</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Handles</td>
			<td>Chilling Incubator (Echotherm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">0.2 &#956;m Vacuum Sterilization Systems</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Blades (#10, #11)</td>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Water-repellant Autoclave Paper</td>
			<td style="width:204px;">Surgical Scissors</td>
			<td>Vacuum Manifold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Serological Pipettes</td>
			<td>Glass Petri Dishes</td>
			<td>Microosmolality Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;"></td>
			<td>12-16 G Cannulas with Luer Locks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:167px;">Plate Size</td>
			<td style="width:192px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:132px;">Poly-L-lysine*</td>
			<td style="width:145px;">Laminin**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.6 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>0.16</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">*0.1 mg/mL concentration</td>
			<td colspan="2">** 0.020 mg/mL concentration</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">Reagent</td>
			<td style="width:155px;">Isolation</td>
			<td style="width:127px;">Wash</td>
			<td style="width:127px;">Dissociation</td>
			<td>Complete</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">Base Medium</td>
			<td>419.25 mL</td>
			<td>395.40 mL</td>
			<td>297.00 mL</td>
			<td>178.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">PSF*</td>
			<td>5.00 mL</td>
			<td>4.00 mL</td>
			<td>3.00 mL</td>
			<td>2.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Gentamicin Sulfate**</td>
			<td>0.75 mL</td>
			<td>0.60 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Donor Equine Serum</td>
			<td>75.00 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Fetal Bovine Serum***</td>
			<td style="width:155px;">-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="19" style="height:19px;width:660px;">* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:75px;">Plate Size</td>
			<td style="width:103px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:145px;">Dilution</td>
			<td style="width:111px;">Plating Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>250 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>150 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>50-100 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 6. Average number of cells per g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Average # cells/g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio rerio</td>
			<td colspan="2">6,400,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Danio dangila</td>
			<td colspan="2">1,783,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Devario aequipinnatus</td>
			<td colspan="2">1,797,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Oncorhynchus mykiss</td>
			<td colspan="2">66,800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 7. Recommended Incubation Temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio/ Devario spp.</td>
			<td colspan="2">26 - 28 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Oncorhynchus/Salmo spp.</td>
			<td colspan="2">10* - 18 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Ambystoma mexicanum</td>
			<td colspan="2">18&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">* Lower temperatures support lower proliferation rates.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary myogenic precursor cell/myoblast cultures from basal vertebrate lineages

Debido a la dificultad y el tiempo inherente implicado con estudiar el programa miogénico in vivo, los sistemas de cultivo primarios derivados de las células madre adultas residentes de músculo esquelético, las células precursoras miogénicas (PSM), han demostrado ser indispensable para nuestra comprensión del desarrollo del músculo esquelético de mamíferos y crecimiento. Particularmente entre los taxones basal de vertebrados, sin embargo, los datos son limitados describir los mecanismos moleculares que controlan la auto-renovación, la proliferación y diferenciación de los PSM. De particular interés son los posibles mecanismos que subyacen a la capacidad de los vertebrados basales a someterse considerable postlarvas miofibra hiperplasia esquelético (es decir, peces teleósteos) y la regeneración completa tras la pérdida apéndice (es decir urodelos anfibios). Además, el uso de mioblastos cultivados podría ayudar en la comprensión de la regeneración y la recapitulación del programa miogénico y las diferencias entre ellos. Aello, se describe en detalle un protocolo robusto y eficiente (y sus variaciones) para aislar y mantener PSM y su progenie, mioblastos y miotubos inmaduros, en cultivo celular como una plataforma para la comprensión de la evolución del programa miogénico, comenzando por el más vertebrados basales. Aprovechando la situación organismo modelo del pez cebra (Danio rerio), informe sobre la aplicación de este protocolo para pequeños peces del clado ciprínidos Danioninae. A la par, este protocolo puede utilizarse para realizar un enfoque comparativo más amplio mediante el aislamiento de los PSM del ajolote mexicano (Ambystomamexicanum) e incluso roedores de laboratorio. Este protocolo se utiliza ampliamente en el estudio de la miogénesis en varias especies de peces, como la trucha arco iris, el salmón, el besugo y 1-4.

Veinticuatro horas después de la siembra, las células precursoras miogénicas (PSM) deben ser visibles adjunto al sustrato de laminina (véanse las figuras 1a y 1d). Después de la siembra, las células (PSM) adoptan una forma de tipo huso, indicativo de este tipo de células (Figura 1) y son MyoD1 + (Figura 2). En las especies Danio, PSM parecen ser más compacto con procesos bipolares más pequeños que hacen PSM de especie Oncorhynchus...

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Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

El cultivo in vitro sistemas han demostrado ser indispensables para nuestra comprensión de la miogénesis de vertebrados. Sin embargo, queda mucho por aprender sobre el desarrollo del músculo esquelético no mamífero y el crecimiento, en particular en los taxones basal. Un protocolo eficiente y robusto para el aislamiento de las células madre adultas de este tejido, las células precursoras miogénicas (PSM), y el mantenimiento de su auto-renovación, la proliferación y la diferenciación en un entorno de cultivo primario permite la identificación de los mecanismos de regulación conservados y divergentes a lo largo los linajes de vertebrados.

Preparación de Primaria Myogenic precursor de célula / cultivos de mioblastos de basales Vertebrados Linajes

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

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Research

JoVE Journal

Biology

20.2K vistas.  University of Alabama at Birmingham.  El cultivo in vitro sistemas han demostrado ser indispensables para nuestra comprensión de la miogénesis de vertebrados. Sin embargo, queda mucho por aprender sobre el desarrollo del músculo esquelético no mamífero y el crecimiento, en particular en los taxones basal. Un protocolo eficiente y robusto para el aislamiento de las células madre adultas de este tejido, las células precursoras miogénicas (PSM), y el mantenimiento de su auto-renovación, la pro...

Video: Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Cultivos neuronales primarios del cerebro de Drosophila pupas etapa tardía

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Investigación

Biología

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparación de cultivos neuronales a partir de embriones de Drosophila Midgastrula Etapa

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Preparación de los cultivos disociados ratón neuronas corticales

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Primaria disociada Mesencéfalo culturas dopamina celulares de roedores recién nacidos

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to the restrictions imposed by a child's small size and their inevitable growth. Consequently, there is a genuine need for innovative therapies designed specifically for pediatric patients with cardiac rhythm disorders. We propose that a conductive biological alternative consisting of a collagen-based matrix containing autologously-derived cells could better adapt to growth, reduce the need for recurrent surgeries, and greatly improve the quality of life for these patients. In the present study, we describe a procedure for incorporating primary skeletal myoblast cell cultures within a hydrogel matrix to fashion a surgically-implantable tissue construct that will serve as an electrical conduit between the upper and lower chambers of the heart. Ultimately, we anticipate using this type of engineered tissue to restore atrioventricular electrical conduction in children with complete heart block. In view of that, we isolate myoblasts from the skeletal muscles of neonatal Lewis rats and plate them onto laminin-coated tissue culture dishes using a modified version of established protocols[2, 3]. After one to two days, cultured cells are collected and mixed with antibiotics, type 1 collagen, Matrigel&trade;, and NaHCO3. The result is a viscous, uniform solution that can be cast into a mold of nearly any shape and size[1, 4, 5]. For our tissue constructs, we employ type 1 collagen isolated from fetal lamb skin using standard procedures[6]. Once the tissue has solidified at 37&deg;C, culture media is carefully added to the plate until the construct is submerged. The engineered tissue is then allowed to further condense through dehydration for 2 more days, at which point it is ready for in vitro assessment or surgical-implantation.

Here, we demonstrate fabrication of collagen-based, tissue constructs containing skeletal myoblasts. These 3-D engineered constructs may be used to replace or repair tissues in vivo. For our purposes, we have designed these as an atrioventricular electrical conduit for the repair of complete heart block[1].

Fabricación de construcciones de ingeniería tisular miogénica

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized. Primary cells are preferred in studies of cell cycle control, apoptosis, and DNA repair, as cancer cells carry mutations in genes involved in these processes. Primary cells cannot be cultured indefinitely due to the onset of replicative senescence or aneuploidization. Hence, new cultures need to be established regularly. The procedure for isolation of rodent embryonic fibroblasts is well established, but isolating adult fibroblast cultures often presents a challenge. Adult rodent fibroblasts isolated from mouse models of human disease may be a preferred control when comparing them to fibroblasts from human patients. Furthermore, adult fibroblasts are the only available material when working with wild rodents where pregnant females cannot be easily obtained. Here we provide a protocol for isolation and culture of adult fibroblasts from rodent skin and lungs. We used this procedure successfully to isolate fibroblasts from over twenty rodent species from laboratory mice and rats to wild rodents such as beaver, porcupine, and squirrel.

This article describes a protocol for isolation and maintenance of primary fibroblast cultures from skin and lung tissue of wild rodents.

El establecimiento de cultivos primarios de fibroblastos de adultos de los roedores

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Cultivos de células primarias de Drosophila Gástrula embriones

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. The large airways therefore require an efficient repair mechanism to protect our bodies. This repair process occurs from stem cells in the airways and isolating these stem cells from the airways is important for understanding the mechanisms of repair and regeneration. It is also important for understanding abnormal repair that can lead to airway diseases 2. The goal of this method is to isolate a novel stem cell population from the mouse tracheal submucosal gland ducts and to place these cells in in vitro and in vivo model systems to identify the mechanisms of repair and regeneration of the submucosal glands 3. This production shows methods that can be used to isolate and assay the duct and basal stem cells from the large airways 3.This will allow us to study diseases of the airway, such as cystic fibrosis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Currently, there are no methods for isolation of submucosal gland duct cells and there are no in vivo models to study the regeneration of submucosal glands.

Here we demonstrate our protocol for isolation of basal and submucosal gland duct cells from mouse tracheas. We also demonstrate the method of injecting stem cells into the dorsal mouse fat pad to create an in vivo model of submucosal gland regeneration.

Aislamiento de células basales y de células submucosas conducto de la glándula de ratón tráquea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Preparación de las células embrionarias de fibroblastos de ratón adecuados para el cultivo de células estaminales embrionarias humanas pluripotentes inducidas, y

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...