Nos gustaría agradecer a los miembros del Laboratorio de Barresi por su apoyo y sus valiosos comentarios sobre este manuscrito. Damos las gracias al Trabajador Alexander por su asistencia técnica permanente, así como el personal de cuidado de los animales por su ayuda en el mantenimiento de la colonia Smith College de pez cebra. También queremos agradecer a Mike Hallacy, Rottenfusser Rudi, y Microfilm Carl Zeiss para el préstamo algunos equipos de microscopía para la Filmin de este protocolo. Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación financiada por la NSF, 0615594.

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio.">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio.</a> The Zebrafish Book. , (2007).</li><li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. e. d. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+A+Practical+Approach.">Zebrafish A Practical Approach.</a> , (2002).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy.">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> J Vis Exp. (26), (2009).</li><li>Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S., N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. e. d. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish,+a+practical+approach.">Zebrafish, a practical approach.</a> 1, 121-121 (2002).</li><li>Woo, K., Shih, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+maps+of+the+zebrafish+embryo.">Fate maps of the zebrafish embryo.</a> Curr Opin Genet Dev. 5 (4), 439-439 (1995).</li><li>Barresi, M. J., Hutson, L. D., Chien, C. B., Karlstrom, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+regulated+Slit+expression+determines+commissure+and+glial+cell+position+in+the+zebrafish+forebrain.">Hedgehog regulated Slit expression determines commissure and glial cell position in the zebrafish forebrain.</a> Development. 132 (16), 3643-3643 (2005).</li><li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein.">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75 (5), 551-551 (1997).</li><li>Halloran, M. C., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-induced+gene+expression+in+specific+cells+of+transgenic+zebrafish.">Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish.</a> Development. 127 (9), 1953-1953 (2000).</li><li>Hardy, M. E., Ross, L. V., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+gene+misexpression+in+zebrafish+embryos+induced+by+local+heat+shock+using+a+modified+soldering+iron.">Focal gene misexpression in zebrafish embryos induced by local heat shock using a modified soldering iron.</a> Dev Dyn. 236 (11), 3071-3071 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La generación de embriones quiméricos es una poderosa herramienta que se ocupa de muchas cuestiones de investigación en sistemas de varios modelos, a saber, la mosca de la fruta (D.melanogaster), gusano (C. elegans), el pez cebra (D.rerio) y el ratón (M.musculus). Nosotros sostenemos que el sistema de modelo de pez cebra es especialmente adecuado para la generación de quimeras de una manera relativamente fácil, rápido y versátil. El pez cebra es un vertebrado que se desarrolla fuera de la madre por lo que es mucho más accesible en comparación con el modelo de ratón. Pez cebra también son significativamente más grandes que las moscas o los gusanos, lo que simplifica la manipulación embriológico, como el trasplante de células. Además, la capacidad de combinar los procedimientos de trasplante de células con las técnicas transgénicas permite una gran variedad de experiencias posibles en que puede ser manipulado en función de los genes de un tejido-específicos localizados manera. Por ejemplo, pequeños clones de GFP + o rodamina células marcadas permiten la caracterización de la morfología de la célula completa que a menudo se pierden en un donante de transgénicos homocigotos o son imposibles de visualizar debido a un etiquetado diferencial subcelular con los anticuerpos comunes. Además, mediante el uso de células transgénicamente etiquetados o llenado con fluorescencia, podemos rastrear las células del donante en el embrión del pez cebra en vivo a través del tiempo. Timelapse imágenes de células individuales ofrece un nuevo análisis del comportamiento celular en el contexto de todo el organismo. Nuestro laboratorio también se combina el uso de choque térmico inducible líneas transgénicas con trasplantes de células de tal manera que ciertas señales de guiado de los axones pueden ser misexpressed en las células del donante después de una elevación de la temperatura de incubación (datos no muestran). Esta técnica es un método extremadamente poderoso y directo a misexpress localmente una proteína de interés de manera espacial y temporal específico, lo que nos permite ver cómo la proteína específica afecta el desarrollo. En nuestro caso, esta técnica se puede ampliar nuestro conocimiento detrás de la función de las señales de orientación Robo de hendidura en el posicionamiento de las comisuras y las células gliales en la línea media 5. Otros enfoques de genes a nivel local como misexpressing uncaging UV focal y herramientas localizadas choque térmico (láser o soldadura de hierro), no ofrecen alternativas para manipular la expresión de genes y marcadores en un pequeño grupo de células 7-9, sin embargo, el trasplante de células establece un entorno final de análisis que está libre de cualquier trauma ocasionado por los rayos ultravioleta, láser o calor haciendo el trasplante de células de un enfoque experimental más controlada. En conclusión, hemos encontrado los procedimientos de trasplante de células a ser una parte crucial de nuestra investigación en biología del desarrollo neurológico. La generación de clones de células con propiedades diferentes es una herramienta fundamental para el biólogo del desarrollo para hacer frente a cuestiones fundamentales de comportamiento celular, la función del gen, y la autonomía de la célula.

<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Tipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Detalles específicos </td></tr><tr><td> Placas de Petri </td><td> Herramienta </td><td> Fisherbrand </td><td> 08-757-13 </td><td> 100 x 15 mm </td></tr><tr><td> Placas de vidrio fondo la cultura </td><td> Herramienta </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-2.0-C </td><td> 35 x 15 mm, no 1.5, sin estucar ni recubrir, irradiados con rayos gamma </td></tr><tr><td> De ancho Diámetro pipetas Pasteur de vidrio </td><td> Herramienta </td><td> Fisherbrand </td><td> 63A-53-WT </td><td></td></tr><tr><td> Capilares de vidrio de filamento a través de moldes (sin filamento) y agujas de inyección (con filamento) </td><td> Herramienta </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 1B150F-4 </td><td> 4 pulgadas (100 mm), 1,5 / 0,84 OD / ID (mm) </td></tr><tr><td> Trasplante capilares (TransferTip) </td><td> Herramienta </td><td> Eppendorf </td><td> 83000122-8 </td><td> Tipo IV, Int. estéril. 15μm, 20 doble grado </td></tr><tr><td> Trasplante de molde </td><td> Herramienta </td><td> Herramientas de adaptación Ciencia </td><td> PT-1 </td><td> 150 chuletas triangular para mantener los embriones individuales </td></tr><tr><td> Agarosa, Tipo I </td><td> Reactivo </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A6013-250G </td><td> Agarosa al 1,5% hecha en EM </td></tr><tr><td> (Antibióticos) de embriones medio </td><td> Reactivo </td><td></td><td></td><td> Ver Westerfield, 2007 </td></tr><tr><td> Tampón fosfato </td><td> Reactivo </td><td></td><td></td><td> Ver Westerfield, 2007 </td></tr><tr><td> Pinzas vigilante </td><td> Herramienta </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td></td><td> 100 + mm punta (sordo), punta de 50 mm </td></tr><tr><td> Rodamina B Dextran </td><td> Lineage trazador de tinta </td><td> Molecular Probes, Invitrogen </td><td> D1824 </td><td> Da 10.000 MW, la lisina puede arreglar, rojo (590nm) tinte fluorescente excitado con el verde (570 nm) la luz </td></tr><tr><td> Microscopio de disección </td><td> Microscopio </td><td> Olimpo </td><td> SZX7 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescente Microscopio Estéreo </td><td> Microscopio </td><td> Zeiss </td><td> Lumar </td><td> Completamente automatizado Joystick Controlados (Sycop) </td></tr><tr><td> Trasplante de aparato </td><td> Herramienta </td><td> Eppendorf Corp. </td><td> Airtram </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulador automatizado </td><td> Herramienta </td><td> Eppendorf Corp. </td><td> TransferMan NK2 </td><td> Joystick controlada </td></tr><tr><td> Micromanipulador </td><td> Herramienta </td><td> Aplicada Scientific Instruments, Inc. </td><td> 00-42-101-0000 </td><td> MM33 Derecho </td></tr><tr><td> Microinyector con la Unidad de contrapresión </td><td> Herramienta </td><td> Aplicada Scientific Instruments, Inc. </td><td> MPPI-2 BPU </td><td></td></tr><tr><td> Flamming / Brown micropipeta Extractor </td><td> Herramienta </td><td> Sutter Instrument Company </td><td> Modelo P97 </td><td> Programa: Heat 550; Velocidad de 200; Tiempo / Delay 200; Tire de la fuerza 120. </td></tr></tbody></table>

tissue targeted embryonic chimeras: zebrafish gastrula cell transplantation

Algunas cuestiones fundamentales en el campo de la biología del desarrollo sólo pueden ser respondidas cuando las células se colocan en entornos nuevos o cuando pequeños grupos de células en un contexto más amplio se han modificado. Ver cómo una célula interactúa y se comporta en un entorno único es esencial para la caracterización de las funciones celulares. Determinar cómo el misexpression localizada de una proteína específica que influye en torno a las células proporciona información detallada sobre el papel que juega la proteína en una variedad de procesos de desarrollo. Nuestro laboratorio utiliza el sistema de modelo de pez cebra para combinar exclusivamente con métodos genéticos clásicos técnicas de trasplante para generar quimeras genotípicos o fenotípicos. Se estudian las neuronas gliales interacciones celulares durante la formación de las comisuras del cerebro anterior en el pez cebra. Este video describe un método que permite a nuestro laboratorio para investigar el papel de las poblaciones astroglial en el diencéfalo y el papel de las señales de orientación específicos que influyen en los axones proyectan al cruzar la línea media. Debido a su transparencia embriones de pez cebra son un modelo ideal para este tipo de colocación de células ectópico o misexpression gen localizado. Seguimiento de las células trasplantadas se puede lograr usando un colorante vital o una línea de peces transgénicos que expresan una proteína fluorescente. Estamos aquí demostrar cómo preparar embriones de donantes con un trazador de tinta vitales para el trasplante, así como la extracción y trasplante de células de un embrión en etapas gástrula a otro. Se presentan datos que muestran ectópico GFP + células transgénicas en el cerebro anterior de embriones de pez cebra y caracterizar la ubicación de estas células con respecto al cerebro anterior comisuras. Además, show de rayos láser microscopía confocal timelapse de Alexa 594 células marcadas trasplantadas a un GFP + embriones transgénicos de acogida. Estos datos proporcionan evidencia de que la gástrula etapas de trasplante permite el posicionamiento específico de las células ectópico para hacer frente a una serie de preguntas de Biología del Desarrollo.

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation at JoVE.com

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Pez cebra trasplante de células permite la combinación de la genética y la embriología para generar quimeras tejido específico. Este vídeo demuestra gástrula etapas trasplantes de células que han permitido a nuestro laboratorio para investigar el papel de las poblaciones de astro y señales específicas de orientación durante la formación de la comisura del cerebro anterior.

Tejido diana quimeras embrionarias: pez cebra Gástrula Trasplante de células

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

tissue-targeted-embryonic-chimeras-zebrafish-gastrula-cell

Research

JoVE Journal

Biology

19.1K vistas.  Smith College. Pez cebra trasplante de células permite la combinación de la genética y la embriología para generar quimeras tejido específico. Este vídeo demuestra gástrula etapas trasplantes de células que han permitido a nuestro laboratorio para investigar el papel de las poblaciones de astro y señales específicas de orientación durante la formación de la comisura del cerebro anterior.