Vorremmo ringraziare i membri del Laboratorio Barresi per il sostegno e utili commenti su questo manoscritto. Ringraziamo Workman Alessandro per la sua costante assistenza tecnica e il personale la cura degli animali per il loro aiuto nel mantenere la Smith College colonia Zebrafish. Ringraziamo anche Hallacy Mike, Rudi Rottenfusser, e Carl Zeiss Microimaging per il prestito alcune attrezzature per la microscopia filmin di questo protocollo. Questo lavoro è stato supportato da un assegno di ricerca finanziato NSF, 0615594.

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio.">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio.</a> The Zebrafish Book. , (2007).</li><li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. e. d. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+A+Practical+Approach.">Zebrafish A Practical Approach.</a> , (2002).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy.">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> J Vis Exp. (26), (2009).</li><li>Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S., N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. e. d. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish,+a+practical+approach.">Zebrafish, a practical approach.</a> 1, 121-121 (2002).</li><li>Woo, K., Shih, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+maps+of+the+zebrafish+embryo.">Fate maps of the zebrafish embryo.</a> Curr Opin Genet Dev. 5 (4), 439-439 (1995).</li><li>Barresi, M. J., Hutson, L. D., Chien, C. B., Karlstrom, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+regulated+Slit+expression+determines+commissure+and+glial+cell+position+in+the+zebrafish+forebrain.">Hedgehog regulated Slit expression determines commissure and glial cell position in the zebrafish forebrain.</a> Development. 132 (16), 3643-3643 (2005).</li><li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein.">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75 (5), 551-551 (1997).</li><li>Halloran, M. C., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-induced+gene+expression+in+specific+cells+of+transgenic+zebrafish.">Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish.</a> Development. 127 (9), 1953-1953 (2000).</li><li>Hardy, M. E., Ross, L. V., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+gene+misexpression+in+zebrafish+embryos+induced+by+local+heat+shock+using+a+modified+soldering+iron.">Focal gene misexpression in zebrafish embryos induced by local heat shock using a modified soldering iron.</a> Dev Dyn. 236 (11), 3071-3071 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Generare embrioni chimera è un potente strumento che affronta problematiche di ricerca all&#39;interno di molti sistemi di modelli diversi, ovvero il moscerino della frutta (D.melanogaster), worm (C.elegans), pesce zebra (D.rerio) e mouse (M.musculus). Noi sosteniamo che il sistema modello Danio rerio è particolarmente adatto per la produzione di chimere in un relativamente facile, veloce e versatile. Il pesce zebra è un vertebrato che si sviluppa al di fuori della madre che lo rende molto più accessibile rispetto al modello murino. Zebrafish sono anche significativamente più grandi mosche o vermi, che semplifica la manipolazione embrionale come il trapianto di cellule. Inoltre, la capacità di combinare le procedure di trapianto di cellule con tecniche transgeniche consente una vasta gamma di esperienze possibili in cui la funzione del gene può essere manipolata in un localizzata tessuto-specifica. Per esempio, piccoli cloni di GFP + o rodamina cellule marcate consentono la caratterizzazione della morfologia delle cellule pieno che spesso si perdono in un donatore transgenici omozigoti o sono impossibili da visualizzare a causa di etichettatura differenziale subcellulare con anticorpi comune. Inoltre, utilizzando cellule transgenically tag o fluorescente pieno, siamo in grado di monitorare le cellule del donatore nell&#39;embrione zebrafish vivere nel tempo. Timelapse immagini delle singole cellule fornisce una nuova analisi del comportamento cellulare nel contesto di tutto l&#39;organismo. Il nostro laboratorio abbina anche l&#39;utilizzo di shock termico inducibile linee transgeniche con trapianti di cellule in modo che alcuni spunti di guida degli assoni possono essere misexpressed nelle cellule del donatore a seguito di un aumento della temperatura di incubazione (dati non dimostrano). Questa tecnica è un approccio estremamente potente e diretto a livello locale misexpress una proteina di interesse in modo spaziale e temporale-specifici, che ci permette di vedere come la proteina specifica influenza lo sviluppo. Nel nostro caso, questa tecnica può estendere le nostre conoscenze base del funzionamento di fessura-Robo spunti guida nel posizionamento delle commissure e cellule gliali sulla linea mediana 5. Altri approcci ai geni a livello locale misexpressing come uncaging UV focale e strumenti heatshock localizzate (laser o saldatore), offrono metodi alternativi per manipolare l&#39;espressione dei geni e marker in un piccolo gruppo di cellule 7-9, tuttavia, stabilisce un trapianto di cellule ambiente finale di analisi che è libero da qualsiasi trauma indotto da UV, laser o termica fare il trapianto di cellule di un approccio più sperimentale controllato. In conclusione, abbiamo trovato le procedure di trapianto di cellule da una parte cruciale della nostra ricerca della biologia dello sviluppo neurologico. Generazione di cloni di cellule con proprietà diverse è uno strumento critico per il biologo dello sviluppo per affrontare questioni fondamentali dei comportamenti delle cellule, la funzione del gene, e l&#39;autonomia delle cellule.

<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Tipo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Specifiche </td></tr><tr><td> Petri </td><td> Strumento </td><td> Fisherbrand </td><td> 08-757-13 </td><td> 100 x 15 mm </td></tr><tr><td> Con fondo in vetro cultura piastre </td><td> Strumento </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-2.0-C </td><td> 35 x 15mm, 1,5 No, non rivestito, gamma-irradiati </td></tr><tr><td> Ampio foro pipette Pasteur in vetro </td><td> Strumento </td><td> Fisherbrand </td><td> 63A-53-WT </td><td></td></tr><tr><td> Di vetro a filamento capillari per stampi attraverso (senza filamento) e aghi di iniezione (con filamento) </td><td> Strumento </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 1B150F-4 </td><td> 4 pollici (100 mm), 1,5 / 0,84 OD / ID (mm) </td></tr><tr><td> Capillari trapianti (TransferTip) </td><td> Strumento </td><td> Eppendorf </td><td> 83000122-8 </td><td> Tipo IV, sterile, int. 15μm, 20 piegare grado </td></tr><tr><td> Trapianto di stampo </td><td> Strumento </td><td> Adaptive Scienza Tools </td><td> PT-1 </td><td> 150 divots triangolare di tenere gli embrioni singoli </td></tr><tr><td> Agarosio, tipo I </td><td> Reagente </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A6013-250G </td><td> Agarosio 1,5% made in EM </td></tr><tr><td> (Antibiotico) Embrione Media </td><td> Reagente </td><td></td><td></td><td> Vedi Westerfield, 2007 </td></tr><tr><td> Tampone fosfato </td><td> Reagente </td><td></td><td></td><td> Vedi Westerfield, 2007 </td></tr><tr><td> Watchman Pinza </td><td> Strumento </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td></td><td> 100 + mm punta (opaco), punta di 50 millimetri </td></tr><tr><td> Rodamina B Destrano </td><td> Lineage tracciante colorante </td><td> Sonde molecolari, Invitrogen </td><td> D1824 </td><td> Da 10.000 MW, lisina risolvibile, rosso (590nm) colorante fluorescente eccitato con verde (570nm) la luce </td></tr><tr><td> Microscopio da dissezione </td><td> Microscopio </td><td> Olimpo </td><td> SZX7 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescente Microscopio Stereo </td><td> Microscopio </td><td> Zeiss </td><td> Lumar </td><td> Fully Automated Joystick controllata (Sycop) </td></tr><tr><td> Apparecchi trapianto </td><td> Strumento </td><td> Eppendorf Corp. </td><td> Airtram </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipolatore automatizzati </td><td> Strumento </td><td> Eppendorf Corp. </td><td> TransferMan NK2 </td><td> Joystick controllata </td></tr><tr><td> Micromanipolatore </td><td> Strumento </td><td> Applied Scientific Instruments, Inc. </td><td> 00-42-101-0000 </td><td> MM33 Destra </td></tr><tr><td> Microinjector con unità di pressione Indietro </td><td> Strumento </td><td> Applied Scientific Instruments, Inc. </td><td> MPPI-2 BPU </td><td></td></tr><tr><td> Flamming / Brown micropipetta Puller </td><td> Strumento </td><td> Sutter strumento aziendale </td><td> Modello P97 </td><td> Programma: Calore 550; Velocity 200; Tempo / ritardo 200; Forza di tiro 120. </td></tr></tbody></table>

tissue targeted embryonic chimeras: zebrafish gastrula cell transplantation

Alcune questioni fondamentali nel campo della biologia dello sviluppo può essere risolta solo quando le cellule si trovano in nuovi ambienti o ambienti in cui piccoli gruppi di cellule in un contesto più ampio sono alterati. Guardando come una cellula interagisce e si comporta in un ambiente unico è essenziale per caratterizzare le funzioni cellulari. Determinare come la misexpression localizzata di una influenza specifica proteina che circonda le cellule fornisce informazioni penetranti sui ruoli che le proteine ​​gioca in una varietà di processi di sviluppo. Il nostro laboratorio utilizza il sistema zebrafish modello di combinare in modo univoco approcci genetici con le tecniche di trapianto classica per generare chimere genotipica o fenotipica. Studiamo neuroni-cellule gliali interazioni durante la formazione delle commissure proencefalo in zebrafish. Questo video descrive un metodo che consente al nostro laboratorio per studiare il ruolo delle popolazioni astrogliali nel diencefalo ed i ruoli di spunti orientamenti specifici che influenzano la progettazione assoni che attraversano la linea mediana. Grazie alla loro trasparenza embrioni di zebrafish sono modelli ideali per questo tipo di posizionamento di cellule ectopiche o misexpression gene localizzato. Monitoraggio cellule trapiantate possono essere eseguite utilizzando un colorante vitale o una linea di pesce transgenici che esprimono una proteina fluorescente. Dimostriamo qui come preparare gli embrioni donatori con un tracciante colorante vitale per il trapianto, e come estrarre e trapianto di cellule da un embrione gastrula messo in scena ad un altro. Vi presentiamo i dati che mostrano ectopica GFP + cellule transgeniche nel proencefalo di embrioni di zebrafish e caratterizzare la posizione di queste cellule rispetto al proencefalo commessure. Inoltre, laser show microscopia confocale a scansione Timelapse di Alexa 594 cellule marcate trapiantate in un GFP + embrione ospitare transgenici. Questi dati forniscono evidenza che gastrula messo in scena il trapianto consente il posizionamento mirato di cellule ectopiche per affrontare una serie di domande di biologia dello sviluppo.

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Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Zebrafish trapianto di cellule consente la combinazione di genetica e dell&#39;embriologia per generare chimere tessuto specifiche. Questo video dimostra gastrula scena trapianti di cellule che hanno permesso al nostro laboratorio per studiare il ruolo delle popolazioni astrogliali e spunti indicazioni specifiche durante la formazione commessura nel proencefalo.

Tessuto Chimere mirate embrionali: Zebrafish gastrula trapianto di cellule

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

tissue-targeted-embryonic-chimeras-zebrafish-gastrula-cell

Research

JoVE Journal

Biology

19.1K Views.  Smith College. Zebrafish trapianto di cellule consente la combinazione di genetica e dell'embriologia per generare chimere tessuto specifiche. Questo video dimostra gastrula scena trapianti di cellule che hanno permesso al nostro laboratorio per studiare il ruolo delle popolazioni astrogliali e spunti indicazioni specifiche durante la formazione commessura nel proencefalo.