Damos las gracias a J. Sedgewick de asistencia en la creación de un microscopio confocal para capturar imágenes de granos de plata; Apoyado en parte por becas de investigación del NIH AI48484 (ATH), AI20048 (RA), y AI066314 (CJM), Centro Nacional de Investigación de Recursos subvención. RR00169 (CNPRC de la Universidad de California, Davis).

Este método se utilizó en la investigación publicada en <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1726">Li et al., Science 323, 1726-1729 (2009)</a> . Combinado en la tinción de tetrámero situ e in situ hibridación (ISTH) procedimientos Procedimientos ISTH se puede dividir en cuatro etapas: 1) IST tinción de antígenos específicos de células T CD8 + en los tejidos, 2) ISH para detectar infectados por el virus de ARN + en las células, y 3) la imagen confocal microscópico de IST células teñidas y viral de ARN + las células, y 4) el análisis de imágenes, incluyendo la construcción de montajes de imágenes y mapas de tetrámero + + y ARN del virus de las células. 1. IST tinción de antígenos específicos de células T CD8 + en secciones de tejido. <ol><li> Cortar los tejidos frescos en 200 secciones um de espesor con un vibratome o un bisturí. </li><li> Frío baño vibratome con PBS estéril-H y el frío a 0-2 ° C. Ajuste el ángulo de la hoja vibratome a un lugar escarpado de 27 °. Siempre que sea posible, mantener los tejidos refrigerados en hielo con el fin de minimizar la degradación. Tejido fresco es más fácil a la sección con un vibratome cuando se enfría. </li><li> Cortar el tejido con unas tijeras o un bisturí quirúrgico en pequeños aproximadamente 0,5 cm de ancho por 0,25 cm de altura piezas. Reunir las piezas de tejido en un barco o un peso pequeño plato y cubrir con ~ 40 ° C derretida 4% PBS buffer de baja fusión de agarosa. Asegúrese de que el tejido está en contacto con el fondo del plato. Empuje las piezas de tejido por si flotan. Consolidar en el hielo. Esto suele tardar entre 3-5 minutos. </li><li> Escudo vibratome bloque de tejido con pegamento Loctite. Corte de agarosa alrededor del tejido con un bisturí, y luego con una pinza, transferir cuidadosamente el frágil tejido de agarosa incrustada en un bloque de vibratome recubiertos de goma. No mueva la pieza de tejido, una vez que se encuentra en el bloque de tejido. Deje secar unos 10 minutos en hielo. </li><li> Monte bloque de tejido en el vibratome y cortar el tejido en 200um de espesor con un muerto a baja velocidad hacia delante y amplitud relativamente alta. Los ajustes de velocidad y amplitud varían con cada vibratome. Si un vibratome no está disponible, o el tejido no es susceptible de vibratome corte, cortar los tejidos en tiras finas con un bisturí. </li><li> Transferencia de las secciones con un pincel en una cámara de tejido fijado en el pozo de una placa de tejido de 24 pocillos que contienen 1 ml de PBS frío-H. Poner un máximo de cuatro secciones de tejido en cada cámara de tejido. Etiqueta de la tapa de la placa de cultivo de tejidos con información de la muestra experimental y la tapa de seguridad a la placa con una goma elástica. </li><li> Por otra parte, para los tejidos que no se corte con vibratome, como intestino, puede cortar tiras finas como sea posible con bisturí o navaja. Ponga sólo una sección por cada bien para las secciones de corte de bisturí. </li><li> Proceder a las manchas inmediatamente después de terminados los tejidos de corte. Mantenga refrigerados secciones para minimizar la degradación en todo momento hasta que fija. No permita que las secciones se sequen. Mantener las secciones en frío PBS estéril-H. </li><li> Incubar las secciones de tejido durante la noche con 0,5 mg / ml tetrámeros conjugado FITC. Puede incluir el ratón o no anticuerpos de conejo dirigidos a epítopos extracelulares en la incubación, por ejemplo, anticuerpos anti-CD8, diluido 1:200 en solución de bloqueo. Use 1 ml de solución por tanto para esta y todas las incubaciones posteriores, y llevar a cabo esta y todas las incubaciones posteriores a 4 ° C con las placas en una plataforma de balanceo. Mantenga cámaras de tejido que contiene diferentes muestras experimentales separadas por al menos un pozo vacío para evitar la contaminación cruzada de las soluciones en los pasos posteriores. </li><li> Después de la incubación primaria, lávese las secciones con PBS frío-H dos veces (2X) durante 20 minutos cada uno. Para ello, la transferencia de las cámaras de tejido a otro de 24 y placa de cultivo de tejido que contiene PBS frío-H. Tenga cuidado de no derramar el contenido de una muestra experimental a otro, al mover cámaras de tejido. Para todas las incubaciones posteriores y se lava de manera similar la transferencia de las cámaras de tejido para un plato limpio, que contiene la solución adecuada. Monitor de las secciones en las cámaras de los tejidos durante el procedimiento para asegurarse de que las secciones no se tiene que quedar a los lados de las cámaras de los tejidos. </li><li> Secciones fijar con tampón PBS paraformaldehído al 4% durante 2 horas a temperatura ambiente. Lavar con PBS frío-H 2 veces 5 minutos cada uno. </li><li> Incubar con conejo anti-FITC anticuerpos, por ejemplo, Biodesign1: 10.000, en solución de bloqueo de uno a tres días. Para co-etiquetado, puede incluir el conejo anticuerpos dirigidos a epítopos intracelulares de esta incubación, así. Para esta opción, exponer epitopos si es necesario y penetrar y bloquear las células antes de la segunda incubación. </li><li> Si los anticuerpos dirigidos a epitopes utilizando intracelular que requiere la recuperación de antígenos de la fijación de formaldehído, exponer epitopos hirviendo 3 veces en urea 0,01 M, 10 segundos cada vez, en un horno de microondas. Esperar 2 minutos entre cada calentamiento. Tenga mucho cuidado como solución en ebullición puede obligar a las secciones de los pozos. Si esto ocurre, use un pincelpara impulsar las secciones de los lados de la cámara de tejido o de la tapa de la placa en la parte inferior de la cámara de tejido apropiado. Si los anticuerpos no requieren la recuperación de antígeno omita este paso. </li><li> Si el uso de anticuerpos dirigidos a epítopos intracelulares, antes de la segunda incubación, permeabolize y bloquear las células en cortes de tejido con PBS-H con 0,3% Triton X-100, y el 2% de suero normal de cabra durante una hora. A continuación, realice restantes incubaciones de anticuerpos en PBS-H que contiene 0,3% de Triton X-100 y 2% de suero normal de cabra. </li><li> Después de la segunda incubación, lavar las secciones en PBS-H por 20 minutos a varias horas. Repetir dos veces para un total de tres lavados. Realizar una incubación final con las correspondientes anticuerpos marcados con fluorescencia. Por ejemplo, cabra anti-conejo-Cy3 y de cabra anti-ratón Alexa 488 diluido 1:1000 en cada una de solución de bloqueo. Incubar durante uno a tres días. Mantener las secciones protegidas de la luz, envolviendo las placas en papel de aluminio durante la incubación y, posteriormente, como fluoróforos apaga la luz. </li><li> Lávese las secciones en PBS-H por 20 minutos a varias horas. Repetir dos veces para un total de tres lavados. </li><li> De IST en combinación con ISH fijar post-post-secciones fijar en paraformaldehído al 4% durante 1 hora para asegurar tetrámeros y los anticuerpos en el lugar, luego enjuague secciones con PBS-H de nuevo y de montaje. </li><li> Utilice una brocha para la transferencia de las secciones de un portaobjetos de microscopio. Cubra cada sección con glicerol / gelatina que contienen 4mg/ml n-propilo u otros medios de montaje que contiene un conservante fluoróforo y cubrir con un cubreobjetos. Diapositivas guardar en un recipiente de luz para diapositivas protegidos en -20 º. Enjuagar las placas de cultivo de tejidos y eliminar etiquetas en las tapas con alcohol. Puede volver a utilizar las placas. </li><li> Analizar las secciones de tejido teñidos con un microscopio confocal. A continuación, puede proceder a la ISH. </li></ol> 2. Detección de infectados por el virus de ARN + células por hibridación in situ. Este protocolo de hibridación in situ fue modificada a partir de los protocolos previamente publicados 4,5 de la siguiente manera: <ol><li> Volver a cortar 5-8 micras de espesor-sectionss de espesor in situ secciones tetrámero de colores. <ol><li> De 200 micrones de espesor de las secciones se calienta a 70 ° C durante 5 minutos para separar la sección de la diapositiva. </li><li> La sección se incrusta en octubre en hielo seco. </li><li> De 8 micrones secciones se cortan con un criostato de las secciones de espesor y se adhiere a las diapositivas silanizada. </li><li> Las diapositivas se pueden almacenar a -80 ° C en una caja sellada para su posterior hibridación in situ. </li></ol></li><li> Hibridación in situ <ol><li> Rehidratar las secciones de tejido por inmersión portaobjetos durante 3 minutos cada uno en el 90% de etanol y agua tratada con DEPC. </li><li> Permeabilizar las secciones de tejidos mediante el calentamiento en tampón citrato 10 mM (pH 6,0) a 98 ° C en un baño de agua durante 15 minutos. </li><li> Secciones de tejido fresco a temperatura ambiente durante 20-30 min. </li><li> Lavar dos veces en agua tratada con DEPC durante 3 min. </li><li> Acetylate sección de tejido mediante la inmersión de diapositivas en el 0,25% de anhídrido acético en 0,1 M de TEA (trietanolamina, pH 8,0) durante 10 minutos. </li><li> Transferencia se desliza dentro de TEA 0,1 M (pH 8,0) durante 5 min. </li><li> Hibridar secciones de 35-S etiquetados específicos del virus (como el VIH-1, SIV) de la sonda antisentido o sentido (control negativo para VIH-1, VIS), o el 35-S etiquetados riboprobes LCMV (sentido común y antisentido). </li><li> Lavar dos veces con secciones 2XSSC durante 5 minutos después de la hibridación noche a la mañana a 42 ° C. </li><li> Lávese las secciones de ECE (0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5) durante 5 min. </li><li> Recopilación de las secciones con RNasas A y T1 en ECE a 37 ° C durante 30 minutos </li><li> Lávese las secciones en 2x SSC, más el 50% de formamida durante 5 min. </li><li> Lávese las secciones en 1x SSC 10 min. </li><li> Lávese las secciones en 0,5 x SSC 15 min. </li><li> Deshidratar secciones 70, 80 y 100% de etanol que contiene 0,3 M de acetato de amonio, cada 5 min. </li><li> Secciones capa de emulsión de trazas nucleares </li><li> Seco en un cuarto oscuro durante 1 hora. </li><li> Exponer las secciones a 4 ° C durante 11 días (SIV) y 3 días (LCM). </li><li> Desarrollar las secciones de D19 (Kodak, Cat # 146 4593) durante 3 minutos, lavar en dH2O 30 segundos, fijar en fijador rápido (Kodak, Cat # 146 4106) durante 4 minutos, lavar en dH2O 5 min x 3 veces. </li><li> Deshidratar en el 70%, 80% y etanol absoluto, a 5 minutos cada uno. </li><li> Montaje se desliza en medio de fluorescentes Permount compatible. </li></ol></li></ol> 3. Adquirir imágenes confocal microscopio. <ol><li> Capturar imágenes con un microscopio ISTH Bio-Rad MRC 1000 confocal, o cualquier otro microscopio confocal con un dispositivo de reflexión Epi2-Blue. </li><li> Use Epi1-605 para el fluorocromo rojo tetrámero, Epi2 DF32-522 para el verde fluorocromo CD8, y la reflexión Epi2-azul para los granos de plata (la señal de ISH en el radioautographs desarrollados) a 20x (por SIV) o 60x (por LCMV) </li><li> Secuencialmente recoger Z-serie imágenes a intervalos de 1 micrón de los tres canales de cada campo. </li><li> Adquirir imágenes de cada sección, de izquierda aderecha y de arriba a abajo, y el nombre de cada imagen de acuerdo a su fila y columna en un archivo de Excel. </li><li> La captura de cada imagen con una superposición de alrededor del 20% con sus imágenes vecinos para evitar vacíos en la imagen reconstruida montaje. </li></ol> 4. Análisis de la imagen: la reconstrucción de imágenes montaje, cálculo de celda centroide y el análisis espacial. <ol><li> Proyecto Z-serie imágenes en una sola imagen para cada canal con el Asistente de Confocal (versión 4.02).. </li><li> Automáticamente la imagen proyectada a partir de tres canales en una imagen RGB, mediante un procedimiento de acción de Photoshop 7.0. </li><li> Generar una imagen de montaje de costura imágenes se fusionaron en capas en Photoshop 7.0. </li><li> Asociado granos de plata individual y tetrámero mancha con las células, y asignar las coordenadas X, Y de los centros (centroides) de la SIV ARN + y las células tetrámero +, con MetaMorph (versión 7.1.3.) O Photoshop (disponible en el autor) </li><li> Exportar datos centroide en archivos de Excel como numéricos para cada celda. E: T ratios se determina a partir de los archivos de Excel a partir del número total de tetrámero + + y el ARN viral celdas de la sección. </li></ol> Las relaciones espaciales entre el rojo y el azul tetrámero + SIV ARN + células son capturados por copiar y pegar sus respectivas parcelas de los archivos de Excel en un documento de Photoshop. Después de bajar la opacidad de una capa de ajuste y escala de las redes para que coincidan, color, seleccionar y copiar y pegar en una nueva capa de las posiciones de la nada ARN + en las células, y luego descartar la capa utilizada para alinear las rejillas, las posiciones del tetrámero + + y el ARN viral células se dará a conocer en la imagen acoplada. 5. Notas adicionales Si el corte de tejidos infecciosos: Trabajar en un laboratorio BSL2.5. Tome precauciones especiales con cuchillas de afeitar. Ponga la máquina de afeitar en la lámina vibratome montaje con una pinza. Si usted no puede poner la hoja con una pinza, luego lo puso en el tejido antes de añadir al baño, y no sustituir a la hoja. Al cortar termine, quite la hoja con una pinza. Rocíe la hoja con un 70% EtOH o DMQ antes de su retirada. Como siempre, a disponer de hojas en un recipiente de objetos punzantes. Cambiar los guantes externos o enjuague con desinfectante después de cada contacto con el tejido o contaminados PBS en el tanque. Cuando haya terminado, si se trabaja con material infeccioso, añadir desinfectante DMQ a PBS en el tanque y dejar reposar un par de minutos antes de retirar. Disponer de descontaminación PBS por el desagüe. Luego enjuague el tanque con agua para eliminar la sal y desinfectante. Espacio de trabajo limpio y los utensilios con DMQ. Enjuague los utensilios con agua. Hacer tetrámeros de MHC biotinilado monómeros: Obtener la clase I del MHC moléculas con biotina como HLA-A * 0201 / B 2 m / moléculas de péptidos producidos, ya sea con la mordaza (SLYNTVATL), Pol (ILKEPVHGV), o irrelevante MART péptido (ELAGIGILTV) péptidos de Beckman Coulter. Biotinilado HLA-A * 0301 / B 2 m / moléculas de péptidos producidos, ya sea con la mordaza (KIRLRPGGK) o NEF (QVPLRPMTYK) en las instalaciones de tetrámero NIAID. Tetrámeros se generan mediante la adición de seis alícuotas de marcado con FITC ExtraAvidin (Sigma) a la biotina Mamu A. * 01 / B 2 m / monómeros de péptidos en el curso de 8 horas a una relación molar final de 4.5:1 El fundamento de la adición de la Extravidin lentamente es que durante los intervalos de tiempo temprano hay un exceso de monómero que asegura que todos los Extravidin se añade a los cuatro sitios de biotina unido. Más tarde, en la reacción, este proceso es menos eficiente porque hay menos monómero a la izquierda y más de una oportunidad que no se han Extravidin los 4 sitios vinculados. Si se añaden todos los Extravidin a la vez que la reacción sería menos eficiente y más moléculas de Extravidin tendría sólo 2 o 3 monómeros unidos.

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	<li>Altman, J. D., Moss, P. A. H., Goulder, P. J. R., Barouch, D. H., McHeyzer-Williams, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li><li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues.">Cutting Edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> Journal of Immunology. 165, 617-61 (2000).</li><li>Qingsheng, L. i., Skinner, P. J., Ha, S. -. J., Duan, L., Mattila, T., Hage, A., White, C., Barber, D. L., O'mara, L., Southern, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcome+in+early+viral+infection.">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcome in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2008).</li><li>Haase, T., Haase, K., Zupancic, M., Sedgewick, G., Faust, R. A., Melroe, H., Cavert, W., Gebhard, K., Staskus, K., Zhang, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perelson+Quantitative+Image+Analysis+of+HIV-1+Infection+in+Lymphoid+Tissue.">Perelson Quantitative Image Analysis of HIV-1 Infection in Lymphoid Tissue.</a> Science. 274, 985-989 (1996).</li><li>Li, Q., Duan, L., Estes, J. D., Ma, Z. M., Rourke, T., Wang, Y., Reilly, C., Carlis, J., Miller, C. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+SIV+replication+in+resting+memory+CD4+T+cells+depletes+gut+lamina+propria+CD4+T+cells.">Peak SIV replication in resting memory CD4 T cells depletes gut lamina propria CD4 T cells.</a> Nature. 434, 1148-1152 (2005).</li><li>Li, Q. i. n. g. s. h. e. n. g., Estes, J. a. c. o. b. D., Schlievert, P. a. t. r. i. c. k. M., Duan, L. i. j. i. e., Brosnahan, A. m. a. n. d. a. J., Southern, P. e. t. e. r. J., Reilly, C. a. v. a. n. S., Peterson, M. a. r. n. i. e. L., Schultz-Darken, N. a. n. c. y., Brunner, K. e. v. i. n. G., Nephew, K. a. r. l. a. R., Pambuccian, S. t. e. f. a. n., Lifson, J. e. f. f. r. e. y. D., &amp;amp, J. o. h. n. V. C. a. r. l. i. s., Haase, A. s. h. l. e. y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycerol+monolaurate+prevents+mucosal+SIV+transmission.">Glycerol monolaurate prevents mucosal SIV transmission.</a> Nature. , (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Puesto que el ARN del virus se utiliza como marcador para las células infectadas por el virus en este informe, todos los reactivos antes de la hibridación debe ser libre de ARNasa. El procedimiento de hibridación in situ descrito aquí ha sido modificado para preservar la señal fluorescente en la tinción de tetrámero situ. Ya que la señal radioautographic de infectados por el virus de las células detectadas por hibridación in situ está a una profundidad de alrededor de un celular de diámetro, las secciones de grueso que se utiliza para la tinción tetrámero situ tienen que ser recortados en 5-8 micras de espesor secciones. Esta nueva técnica de combinar en tetrámeros situ e hibridación in situ (ISTH) se describe aquí permite la visualización simultánea, la cartografía y el análisis de la relación espacial de virus específicos de las células CD8 + T y las células infectadas por el virus de destino. Este método puede ser aplicado para evaluar la vacuna de células CD8 + T y basado en otros que no son virus patógenos y las interacciones huésped. El método de análisis de imagen se describe aquí también se puede adaptar para estudiar las relaciones espaciales de cualquier población de dos células que interactúan en situ, por ejemplo, recientemente hemos utilizado el procedimiento de asignación de centro de gravedad en el estudio del VIH-1 la transmisión sexual en el modelo de primate no humano de la inmunodeficiencia simia infección por el virus de macacos rhesus 6

Soluciones y reactivos: <ul><li> PBS-H tampón fosfato salina que contiene heparina (100ug/ml o 18.7U/ml) para inhibir la RNasas </li><li> RPMI medios de cultivo de tejidos que contienen heparina (100ug/ml o 18.7U/ml) para inhibir la RNasas </li><li> 4% de agarosa de baja fusión en PBS </li><li> PBS con suero de cabra 2% de lo normal (o suero de especies en las que los anticuerpos conjugados fluoróforo se hicieron). </li><li> PBS con suero de cabra normal de un 2% y el 0,3% de Triton X-100 </li><li> MHC de clase I tetrámeros conjugado con FITC </li><li> Anti-FITC anticuerpos, por ejemplo, de Biodiseño de conejo anti-FITC </li><li> Fluoróforo conjugada anti-IgG de conejo que ha sido altamente cruz absorbido a otras especies de IgG para su uso con el etiquetado múltiple, por ejemplo, de cabra anti-conejo-Cy3 </li><li> Fluoróforo conjugada anti-IgG de ratón que ha sido altamente cruz absorbido a otras especies de IgG para su uso con múltiples etiquetado </li><li> PBS tamponado paraformaldehído al 4% </li><li> 0,01 M de urea </li><li> Glicerol / gelatina que contienen 4mg/ml n-propilo </li></ul> Equipo especial <ul><li> Vibratome </li><li> Bisturí </li><li> Hojas de afeitar </li><li> Tijeras quirúrgicas </li><li> Loctite Quick Set adhesivo instantáneo (producto # 46551) </li><li> Fórceps </li><li> # 2 pinceles de pelo de camello. Puede recortar con cuchilla de afeitar en el espesor deseado </li><li> 24 y placas de fondo plano la cultura por ejemplo, tejido Falcon Catálogo # 353226 </li><li> Cámaras de tejido </li><li> Papel de aluminio </li><li> Carpeta de cartón de diapositivas por ejemplo, Fisher Catálogo # 12-587-10 </li><li> Microscopio confocal </li></ul> IST reactivos de referencia rápida PBS-H (tampón fosfato salino con heparina) <ul><li> 450 ml de PBS 1X </li><li> 50 ml 1X PBS + heparina 10 veces </li></ul> 1x PBS + heparina 10 veces <ul><li> 500 ml de PBS 1X </li><li> 500 mg de heparina en polvo (que se encuentra en la plataforma de almacenamiento en seco químico) </li></ul> NGS PBS-H / 2% (suero normal de cabra) <ul><li> 49 ml de PBS-H en tubo Falcon </li><li> 1 ml NGS (que se encuentra en alícuotas de 1 ml a -20 congelador) </li></ul> NGS PBS-H / 2% / 0,3% Triton X-100 <ul><li> 49 ml de PBS-H / 0,3% Triton X-100 en el tubo Falcon </li><li> 1 ml NGS (que se encuentra en alícuotas de 1 ml a -20 congelador) </li></ul> PBS-H / 0,3% Triton X-100 <ul><li> 500 ml de PBS-H </li><li> 1,5 ml de Triton X-100 (este es un líquido espeso se encuentran en los estantes de almacenamiento de químicos secos) </li></ul> 4% de agarosa LMP <ul><li> 2 g de agarosa LMP en polvo </li><li> 50 ml de PBS </li><li> Agitar hasta microondas mixtos, hasta que el polvo se disuelva. </li></ul> GG-NPG (glicerol gelatina con n-propil galato <ul><li> Coloque una botella de glicerina de gelatina en baño de agua 50 grados para fundir </li><li> Añadir 0,06 g de galato de propilo (que se encuentra en el estante Terris), agitar bien </li><li> Tenga en baño de agua, agitando de vez en cuando hasta que se disuelva. </li><li> Alícuota en 1 ml de tubos (tubos de color marrón) </li></ul> Paraformaldehído al 4% <ul><li> 4 g de polvo de paraformaldehído (se encuentra en los estantes de almacenamiento de químicos secos) </li><li> Ponga unos 10 ml de PBS-H en un cilindro graduado, añada el polvo pf </li><li> Añadir un poco de agua hasta que el volumen llegue a unos 70 ml </li><li> Añadir un gotero de NaOH. </li><li> Revuelva hasta que se disuelva (generalmente unos 20-30 minutos) </li><li> Agregar HCl hasta pH alcanza entre 7-8. </li><li> Alcanzar un volumen de 100 ml con agua. </li></ul> Urea 0,01 M <ul><li> 0,3 g de urea (se encuentra en los estantes de almacenamiento de químicos secos) </li><li> 500 ml de agua </li></ul>

a technique to simultaneously visualize virus-specific cd8+ t cells and virus-infected cells in situ

El número y ubicación de virus específicos de células T CD8 + en relación con el número y la ubicación de sus objetivos de la célula infectada se cree que es fundamental para determinar los resultados que van desde la eliminación de las infecciones crónicas persistentes. Se describe aquí un método para evaluar las relaciones espaciales y cuantitativas entre efectoras inmunes (E) específica para el virus células T CD8 + y objetivos infectados (T), que combina in situ tetrámero (IST) de tinción para detectar el virus específico de células T CD8 + e in situ hibridación (ISH) para detectar ARN viral + células en los tejidos donde la batalla entre las defensas inmunes y la infección se lleva a cabo. La combinación de la tinción de IST e ISH, abreviado ISTH, permite la visualización y mapeo de la ubicación de las células efectoras inmunes y los objetivos y la determinación fácil del E: T ratios. Estos parámetros, a su vez puede ser utilizado para determinar las relaciones entre la proximidad espacial, y la oportunidad y la magnitud de la respuesta inmune que predicen los resultados en la infección temprana.

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A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

Una técnica que combina en la tinción de tetrámero situ e hibridación in situ (ISTH) permite la visualización, la cartografía y el análisis de la proximidad espacial de virus específicos de células T CD8 + a sus infectados por el virus objetivos y la determinación de las relaciones cuantitativas entre estos efectores inmunes y los objetivos a los resultados de la infección.

Una técnica para visualizar simultáneamente específica para el virus las células CD8 + T y células infectadas por virus In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

a-technique-to-simultaneously-visualize-virus-specific-cd8-t-cells

Research

JoVE Journal

Biology

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

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Regulatory T cells: Therapeutic Potential for Treating Transplant Rejection and Type I Diabetes

Las células T reguladoras: potencial terapéutico para el tratamiento de rechazo de trasplantes y diabetes tipo I

Investigación

Biología

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

Mensajeras de las células hematopoyéticas de la médula ósea

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

En Fraccionamiento subcelular situ de células mamíferas adherentes y no adherentes-

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Aislamiento de células endoteliales valvular

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Ensayo clonigénicas: las células adherentes

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated precursors. Researchers have employed various methods of lineage labeling, such as DiI labeling1 and pressure injection of traceable enzymes2 to ascertain cell fate at later stages of development in model systems. The first fate maps in zebrafish (Danio rerio) were assembled by iontophoretic injection of fluorescent dyes, such as rhodamine dextran, into single cells in discrete regions of the embryo and tracing the labeled cell's fate over time3-5. While effective, these methods are technically demanding and require specialized equipment not commonly found in zebrafish labs. Recently, photoconvertable fluorescent proteins, such as Eos and Kaede, which irreversibly switch from green to red fluorescence when exposed to ultraviolet light, are seeing increased use in zebrafish6-8. The optical clarity of the zebrafish embryo and the relative ease of transgenesis have made these particularily attractive tools for lineage labeling and to observe the migration of cells in vivo7. Despite their utility, these proteins have some disadvantages compared to dye-mediated lineage labeling methods. The most crucial is the difficulty we have found in obtaining high 3-D resolution during photoconversion of these proteins. In this light, perhaps the best combination of resolution and ease of use for lineage labeling in zebrafish makes use of caged fluorescein dextran, a fluorescent dye that is bound to a quenching group that masks its fluorescence9. The dye can then be "uncaged" (released from the quenching group) within a specific cell using UV light from a laser or mercury lamp, allowing visualization of its fluorescence or immunodetection. Unlike iontophoretic methods, caged fluorescein can be injected with standard injection apparatuses and uncaged with an epifluorescence microscope equipped with a pinhole10. In addition, antibodies against fluorescein detect only the uncaged form, and the epitope survives fixation well11. Finally, caged fluorescein can be activated with very high 3-D resolution, especially if two-photon microscopy is employed 12,13. This protocol describes a method of lineage labeling by caged fluorescein and laser uncaging. Subsequenctly, uncaged fluorescein is detected simultaneously with other epitopes such as GFP by labeling with antibodies.

This protocol delineates a way to label and trace the fate of small groups of cells zebrafish embryos using UV-uncaging of caged fluorescein, followed by whole mount immunolabeling to amplify the signal from the uncaged fluorescein.

Etiquetado linaje de células de pez cebra con láser Uncagable fluoresceína Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Una interfaz gráfica de usuario para el seguimiento asistido por software de la concentración de proteínas en protones dinámicos celulares

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

Tinción Inmunofluorescente In Situ de Autofagia en Células Madre Musculares

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...