Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología de células T y el desarrollo de vacunas vectoriales virales. La principal ventaja de este método es que sólo se necesitan pequeñas cantidades de sangre, lo que permite mediciones repetidas desde el mismo ratón. Además, los CTL específicos del virus y del transgén se pueden detectar a partir de la misma muestra.
Demostrando el procedimiento estarán Jasmine Rinnofner, una técnico, y Annika Rossler, una estudiante de posgrado. Medir y analizar las muestras será Zoltan Banki, un post-doc. Para empezar, restringir de forma segura un ratón de acuerdo con el protocolo de texto.
Recoger 20 microlitros de sangre en un tubo recubierto de EDTA de la vena de la cola de un ratón. Cuando trabaje con esplenocitos, aísle el bazo y utilice el émbolo de una jeringa para presionar el tejido a través de un colador celular. Después de realizar la lelisis en los eritrocitos, cuente las células y ajuste la concentración de la muestra.
Preparar y etiquetar un tubo Facs para cada muestra, y transferir 100 microlitros de suspensión de órganos, o 20 microlitros de sangre al tubo. Cuando trabaje con eslenocitos, centrifuga la suspensión del órgano durante cinco minutos y deseche el sobrenadante. Luego, vórtice el tubo para resuspender el pellet celular.
Para cada canal a utilizar, también prepare un tubo Facs para una muestra de compensación. Prepare una muestra adicional como un control no detenido. Prepare un tubo con tampones Facs con tetrámeros en sus diluciones óptimas y vórtice para mezclar.
A continuación, agregue 50 microlitros de la dilución del tetrámero a cada muestra y vórtice para mezclar. Agregue el búfer Facs sin tetrámeros a los controles de compensación y a la muestra no contenida. A continuación, incubar las muestras en condiciones oscuras a 37 grados centígrados durante 20 minutos.
Mientras las muestras incuban, agregue el tampón Facs a un tubo. A continuación, añada los anticuerpos al búfer de acuerdo con las diluciones especificadas en la Tabla 2 del protocolo de texto y vórtice la solución. Pendientes de la cuestión científica, las combinaciones de marcadores, aparte de las descritas aquí, podrían utilizarse.
Asegúrese de incluir siempre anticuerpos contra CD3 y CD8 en el panel. Para cada canal, prepare un tubo con 200 microlitros de tampón Facs, y agregue una microlitros de una dilución de anticuerpos contra CD8 en su color respectivo, y vórtice para mezclar. A continuación, almacene las diluciones de anticuerpos como se especifica en el protocolo de texto.
Para lavar las muestras, añada un mililitro de tampón Facs a las muestras y centrífuga. A continuación, deseche el sobrenadante y escurra el líquido restante con toallas de papel. Cuando trabaje con sangre, tenga cuidado al drenar el líquido restante.
Antes de la lelisis de los eritrocitos, la sangre no se pegará en la parte inferior del tubo. Alternativamente, puede aspirar el sobrenadante. A continuación, agregue 50 microlitros de la solución de anticuerpos a cada pellet celular y vórtice suavemente.
Agregue 50 microlitros de cada mezcla de compensación al control de compensación correspondiente, y 50 microlitros de Facs buffer al pellet celular del control no manchado, y el vórtice suavemente. Cuando trabaje con esplenocitos, lave las muestras después de la tinción de anticuerpos directamente con uno o dos mililitros de tampón Facs y centrifugar durante cinco minutos. A continuación, deseche el sobrenadante y escurra el líquido restante en toallas de papel.
Agregue 500 microlitros de tampón ACK a cada muestra de sangre y vórtice suavemente. Luego, incubar las muestras en la oscuridad durante cinco minutos a temperatura ambiente. Agregue un mililitro de búfer Facs a las muestras y centrífuga.
A continuación, deseche el sobrenadante y escurra el líquido restante con toallas de papel. La lelisis adecuada de los eritrocitos es un paso crucial para facilitar la medición del Facs, por lo tanto, cuando el pellet está bastante húmedo, repetir la lysis de los eritrocitos. Lave las muestras de nuevo como se describió anteriormente.
A continuación, deseche el sobrenadante y escurra el líquido restante sobre una toalla de papel. Antes de la fijación, asegúrese de que las células estén bien resuspendidas para evitar la formación de grumos. Agregue de 150 a 300 microlitros de tampón de fijación Facs a cada tubo y vórtice para mezclar.
A continuación, proceda con la medición citométrica de flujo lo más rápido posible. En primer lugar, mida los controles de compensación y corrija cualquier superposición espectral. Después, configure puertas secuenciales para seleccionar celdas CD3 positivas y CD8 positivas.
Puerta en los linfocitos usando el área de dispersión hacia adelante y hacia un lado. Luego, dentro de la población de linfocitos, puerta en las células individuales usando el ancho de dispersión hacia adelante versus el área. Utilice canales CD3 y CD8 para trazar linfocitos unicelulares.
Identifique las células T CD8 positivas, mediante el gating en células CD3 positivas y CD8 positivas. Asegúrese de que las celdas CD8-bajas se incluyen en el gating. La propagación en células CD3/CD8-positivas es un paso crítico en este protocolo.
Como la activación de las células a menudo conduce a la regulación de CD3 y/ o CD8, también deben incluirse células CD3/CD8-bajas. Después de esto, trazar las células CD8 positivas frente a las células tetrómeros, gating en las células CD8-positivas/tetramér positivas. Si es posible, registre 20.000 celdas en la puerta CD3-positiva y CD8-positiva para cada muestra.
Por último, guarde las medidas como un archivo FCS. En este protocolo, las células CD8+T específicas de antígenos se detectaron cuantitativamente en muestras de sangre y tejidos. Después de atada las células CD3 positivas y CD8-positivas, se identificaron células tetramérico-positivas.
Dos tetrámeros diferentes se combinaron en el mismo tubo para la tinción, lo que permite la cuantificación simultánea de dos especificidades CTL diferentes. Usando este protocolo, las respuestas de las células T del mismo ratón se pueden seguir con el tiempo, ya que solo se necesitan pequeñas cantidades de sangre para cada medición. Además, se pueden analizar fenotipos de CTL específicos de antígenos.
Al intentar este procedimiento, es importante evitar tiempos de incubación prolongados, ya que esto puede conducir a la internalización de los receptores de células T. Desde el descubrimiento de la tecnología de tetrámeros, la tinción de tetrámeros se ha convertido en una herramienta esencial para el análisis de células T, y una amplia gama de aplicaciones, que incluyen tetramers devengo. Un futuro brillante para los tetrámeros brillantes.
