Nous remercions J. Sedgewick d&#39;assistance dans la mise en place du microscope confocal pour capturer des images de grains d&#39;argent; Soutenu en partie par des subventions de recherche du NIH AI48484 (ATH), AI20048 (RA), et AI066314 (CJM); Centre National de Recherche Ressources subvention. RR00169 (CNPRC, University of California, Davis).

Cette méthode a été utilisée dans la recherche présentée dans <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1726">Li et al., Science 323, 1726-1729 (2009)</a> . Combiné à la coloration tétramère situ et in situ d&#39;hybridation (ISTH) des procédures Coloration TSI 1) de l&#39;antigène spécifique cellules T CD8 + dans les tissus; 2) ISH pour détecter infectées par le virus-ARN + cellules, 3) l&#39;imagerie confocale microscopique des IST cellules colorées et virales ARN +: procédures ISTH peut être divisé en 4 étapes cellules; 4) l&#39;analyse d&#39;images, y compris la construction des montages d&#39;images et la cartographie des tétramère + et un virus à ARN + cellules. 1. Coloration des IST spécifiques de l&#39;antigène T CD8 + dans les coupes de tissus. <ol><li> Couper les tissus frais dans 200 um d&#39;épaisseur des sections en utilisant un vibratome ou un scalpel. </li><li> Réfrigérer vibratome bain avec du PBS stérile et chill-H à 0-2 ° C. Régler l&#39;angle des pales vibratome à un 27 assez raide °. Autant que possible, de garder les tissus refroidis sur la glace afin de minimiser la dégradation. Les tissus frais est également plus facile à l&#39;aide d&#39;une section vibratome quand il est refroidi. </li><li> Coupez le tissu avec des ciseaux ou un scalpel chirurgical en petits gamme d&#39;environ 0.5cm par des morceaux cm 0,25 de haut. Mettez les morceaux de tissus dans un bateau peser ou petit plat et couvrir avec ~ 40 ° C fondu 4% PBS tamponné peu fondre l&#39;agarose. Assurez-vous que le tissu est en contact avec le fond du plat. Poussez les morceaux de tissu vers le bas si ils flottent. Solidifier sur la glace. Cela prend généralement 3-5 minutes. </li><li> Manteau de bloc de tissu avec de la colle Loctite vibratome. Couper agarose autour du tissu avec un scalpel, puis en utilisant une pince, transférer soigneusement le tissu fragile agarose intégrés à un bloc vibratome recouvert de colle. Ne déplacez pas le morceau de tissu une fois qu&#39;il est fixé sur le bloc de tissu. Laisser sécher environ 10 minutes sur la glace. </li><li> Bloc de tissu dans le mont vibratome et couper le tissu dans les sections épaisses 200um en utilisant une vitesse lente morte avant et d&#39;amplitude relativement élevée. Les réglages de vitesse et l&#39;amplitude varie avec chaque vibratome. Si un vibratome n&#39;est pas disponible, ou le tissu ne se prête pas aux vibratome sectionnement, couper les tissus en fines lanières à l&#39;aide d&#39;un scalpel. </li><li> Transfert des sections avec un pinceau dans une chambre de tissus fixés dans le puits d&#39;une plaque de 24 puits de culture de tissu contenant 1 ml de PBS refroidi-H. Mettez un maximum de quatre sections de tissu dans chaque chambre des tissus. Étiquetez le couvercle de la plaque de culture tissulaire avec des informations échantillon expérimental et verrouiller le couvercle à la plaque avec une bande élastique. </li><li> Sinon, pour les tissus qui ne sont pas coupés bien avec vibratome, comme l&#39;intestin, peut couper aussi fine que possible avec des bandes lame de scalpel ou un rasoir. Mettez une seule section par puits pour les sections coupées scalpel. </li><li> Procéder à une coloration des tissus finis immédiatement après la coupe. Gardez sections réfrigérées pour minimiser la dégradation en tout temps jusqu&#39;à fixe. Ne laissez pas sécher les sections. Gardez sections réfrigérées PBS stérile-H. </li><li> Incuber les coupes de tissus pendant une nuit avec 0,5 mg / ml FITC conjugué tétramères. Peut inclure des souris ou de lapin non-anticorps dirigés au épitopes extracellulaires de cette incubation, par exemple, anticorps anti-CD8, dilué 1:200 dans une solution de blocage. Utiliser 1 ml de solution par puits pour cela, et toutes les incubations ultérieures, et d&#39;effectuer cela et toutes les incubations ultérieures à 4 ° C avec des plaques sur une plateforme à bascule. Gardez chambres de tissu contenant différents échantillons expérimentaux séparés par au moins un puits vide pour éviter la contamination croisée de solutions dans les étapes ultérieures. </li><li> Après une incubation primaire, lavez sections avec PBS refroidi-H deux fois (2X) pendant 20 minutes chacun. Pour ce faire, en transférant les chambres de tissu à un autre de 24 puits plaque de culture tissulaire contenant du PBS refroidi-H. Attention à ne pas goutte à goutte le contenu d&#39;un échantillon expérimental dans un autre, lors du déplacement chambres de tissu. Pour toutes les incubations et les lavages ultérieurs de la même transférer les chambres de tissu à une assiette propre contenant la solution appropriée. Moniteur sections dans les chambres des tissus pendant la procédure pour s&#39;assurer que les articles ne restez pas coincé sur les côtés de la chambre des tissus. </li><li> Sections Fix avec du PBS frais tamponné paraformaldéhyde à 4% pendant 2 heures à température ambiante. Laver avec du PBS froid-H 2x 5 min chacune. </li><li> Incuber de lapin anti-FITC anticorps, par exemple Biodesign1: 10000, dans une solution de blocage pendant un à trois jours. Pour la co-marquage, peuvent inclure non-lapin des anticorps dirigés au épitopes intracellulaires dans cette incubation ainsi. Pour cette option, d&#39;exposer des épitopes si nécessaire et le perméat et de bloquer les cellules avant la seconde incubation. </li><li> Si aide d&#39;anticorps dirigés au épitopes intracellulaires qui nécessitent récupération d&#39;antigène de la fixation de formaldéhyde, d&#39;exposer des épitopes en faisant bouillir 3 fois en urée 0,01 M, 10 secondes à chaque fois, dans un four à micro-ondes. Attendre 2 minutes entre chaque chauffage. Soyez très prudent tant que solution bouillante peut forcer les sections hors des puits. Si cela se produit, utilisez un pinceaupour pousser les sections sur les côtés de la chambre de tissu ou du couvercle de la plaque arrière dans le fond de la chambre de tissu approprié. Si des anticorps n&#39;ont pas besoin de récupération d&#39;antigène omettre cette étape. </li><li> Si utilisant des anticorps dirigés au épitopes intracellulaires, avant la seconde incubation, permeabolize et bloquer les cellules dans des coupes de tissus avec du PBS-H contenant 0,3% Triton X-100, et 2% de sérum de chèvre normal pendant une heure. Effectuez ensuite les incubations d&#39;anticorps restant dans du PBS-H contenant 0,3% de Triton X-100 et du sérum de chèvre normal à 2%. </li><li> Après une incubation de seconde, se laver les sections en PBS-H pendant 20 minutes à plusieurs heures. Répéter deux fois pour un total de trois lavages. Effectuer une incubation finale avec les anticorps appropriés marqués par fluorescence. Par exemple, de chèvre anti-lapin-Cy3 et chèvre anti-souris-Alexa 488 dilué 1:1000 chacun dans une solution de blocage. Incuber pendant un à trois jours. Gardez sections protégées de la lumière en enveloppant les plaques dans une feuille d&#39;étain pendant cette incubation et par la suite, comme fluorophores désaltère lumière. </li><li> Lavez sections en PBS-H pendant 20 minutes à plusieurs heures. Répéter deux fois pour un total de trois lavages. </li><li> Pour TSI combiné avec l&#39;ISH de post-correction des sections post-fixer dans du paraformaldéhyde 4% pendant 1 heure pour sécuriser tétramères et d&#39;anticorps en place, puis rincer avec PBS-sections H et monter à nouveau. </li><li> Utilisez un pinceau pour transférer des sections d&#39;une lame de microscope. Enrober chaque section avec glycérol / gélatine contenant 4mg/ml n-propyle gallate ou d&#39;autres supports de montage contenant un conservateur fluorophore et couvrir avec une lamelle. Diapositives Conserver dans un récipient glisser la lumière protégés à -20 °. Rincer les plaques de culture de tissus et enlever les étiquettes sur les couvercles avec de l&#39;alcool. Pouvez réutiliser les plaques. </li><li> Analyser des coupes de tissus colorés avec un microscope confocal. Puis peut procéder à l&#39;ISH. </li></ol> 2. Détecter infectées par le virus-ARN + cellules par hybridation in situ. Cette hybridation in situ dans le protocole a été modifié par nos protocoles publiés antérieurement 4,5 comme suit: <ol><li> Recoupez 5-8-micron d&#39;épaisseur-sectionss d&#39;épaisseur in situ coupes colorées tétramère. <ol><li> 200 microns d&#39;épaisseur des sections sont chauffés à 70 ° C pendant 5 min pour détacher la section de la diapositive. </li><li> La section est ensuite intégré dans les PTOM sur glace sèche. </li><li> 8 microns sections sont coupés avec un cryostat à partir des sections épaisses et respectées diapositives silanisé. </li><li> Les diapositives peuvent être conservés à -80 ° C dans une boîte scellée pour subséquentes hybridation in situ. </li></ol></li><li> Hybridation in situ <ol><li> Réhydrater des coupes de tissus en immergeant les lames pendant 3 minutes dans chacune des éthanol à 90% et DEPC eau traitée. </li><li> Perméabiliser des coupes de tissus par chauffage dans un tampon citrate 10mM (pH 6,0) à 98 ° C dans un bain-marie pendant 15 min. </li><li> Coupes de tissus refroidir à température ambiante pendant 20-30 min. </li><li> Laver deux fois dans l&#39;eau traitée par DEPC pendant 3 min. </li><li> Acétyler coupe de tissu en immergeant glisse dans l&#39;anhydride acétique 0,25% dans 0,1 M de TEA (triéthanolamine, pH 8,0) pendant 10 min. </li><li> Transfert glisse dans 0,1 M TEA (pH 8,0) pendant 5 min. </li><li> Hybrider sections à 35 S-étiquetés spécifiques du virus (comme le VIH-1, SIV) sonde antisens ou sens (contrôle négatif pour le VIH-1, SIV), ou 35 S-étiquetés ribosondes LCMV (sens commun et antisens). </li><li> Laver deux fois avec des sections 2xSSC pendant 5 min après hybridation nuit à 42 ° C. </li><li> Lavez sections à STE (0,5 M de NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCL, pH 7,5) pendant 5 min. </li><li> Recueil des sections avec des RNases A et T1 à STE à 37 ° C pendant 30 min </li><li> Lavez sections dans 2x SSC, plus 50% de formamide pendant 5 min. </li><li> Lavez sections dans 1x SSC 10 min. </li><li> Lavez sections en 0,5 x SSC 15 min. </li><li> Déshydrater sections 70, 80 et 100% d&#39;éthanol contenant 0,3 M d&#39;acétate d&#39;ammonium, chaque 5 min. </li><li> Manteau sections avec l&#39;émulsion de traces nucléaires </li><li> Sec dans une pièce sombre pendant 1 heure. </li><li> Exposer des sections à 4 ° C pour 11 jours (SIV) et 3 jours (LCMV). </li><li> Développer sections D19 (Kodak, Cat # 146 4593) pendant 3 min, laver à l&#39;dH2O 30 secondes, fixer dans le fixateur rapide (Kodak, Cat # 146 4106) pendant 4 min, laver à l&#39;dH2O 5 min x 3 fois. </li><li> Déshydrater dans 70%, 80% et d&#39;éthanol absolu, à 5 min chacune. </li><li> Diapositives mont de fluorescence moyenne Permount compatibles. </li></ol></li></ol> 3. Acquérir les images microscope confocal. <ol><li> Capturez des images avec un microscope ISTH Bio-Rad 1000 MRC confocale, ou tout autre microscope confocal avec dispositif de réflexion Epi2-Bleu. </li><li> Utilisez Epi1-605 pour le fluorochrome rouge tétramère, Epi2 DF32-522 pour le vert fluorochrome CD8, et la réflexion Epi2-Bleu pour les grains d&#39;argent (signal ISH dans le radioautographs développés) à 20x (pour SIV) ou 60x (pour LCMV) </li><li> Séquentiellement collecter des Z-série d&#39;images à des intervalles de 1 micron dans les trois canaux de chaque champ. </li><li> Acquérir les images de chaque section de gauche àimage de droite et de haut en bas, et le nom de chacun selon son rang et de colonne dans un fichier Excel. </li><li> Capturez chaque image avec un chevauchement ~ 20% avec ses images voisines pour éviter des lacunes dans l&#39;image reconstruite montage. </li></ol> 4. Analyses Image: Montage de reconstruction d&#39;image, calcul de cellule centroïde et l&#39;analyse spatiale. <ol><li> Projet Z-série d&#39;images en une seule image pour chaque canal avec l&#39;assistant confocale (version 4.02).. </li><li> Fusionner automatiquement l&#39;image projetée à partir de trois canaux dans une image RVB, en utilisant une procédure d&#39;action de Photoshop 7.0. </li><li> Générer une image montage par piquage des images fusionnées en couches dans Photoshop 7.0. </li><li> Associé grains d&#39;argent individuelle et tétramère tache avec les cellules, et assigner les coordonnées X, Y des centres (centroïdes) de l&#39;ARN et + SIV tétramère cellules +, en utilisant MetaMorph (version 7.1.3.) Ou Photoshop (disponible auprès de l&#39;auteur) </li><li> Exporter des données dans des fichiers Excel centroïde que les numéros numérique pour chaque cellule. E: T ratios sont déterminés à partir des fichiers Excel à partir du nombre total de tétramère + + et l&#39;ARN viral des cellules dans la section. </li></ol> Les relations spatiales entre le rouge et le bleu tétramère + SIV ARN des cellules + sont capturées en copiant et collant leurs parcelles respectives à partir des fichiers Excel dans un document Photoshop. Après avoir diminué l&#39;opacité d&#39;un calque d&#39;aligner et de l&#39;échelle les grilles de sorte qu&#39;ils coïncident, couleur sélectionner et copier et coller dans un nouveau calque les positions des bleus ARN + cellules, puis jeter la couche utilisée pour aligner les grilles, les positions de l&#39;+ tétramère et l&#39;ARN viral + cellules sera révélé dans l&#39;image aplatie. 5. Notes complémentaires Si l&#39;on coupe des tissus infectieux: Travailler dans un laboratoire BSL2.5. Prenez des précautions particulières avec des lames de rasoir. Mettez le rasoir dans la lame vibratome monter avec une pince. Si vous ne pouvez pas mettre la lame avec une pince, puis le mettre dans le tissu avant d&#39;ajouter au bain, et ne pas remplacer la lame. Lors de la coupe terminée, retirez la lame avec une pince. Vaporiser la lame avec 70% EtOH ou DMQ avant leur enlèvement. Comme toujours, disposer des lames dans un contenant pour objets pointus. Changer de gants extérieure ou rincer dans une solution désinfectante après chaque contact avec un tissu ou contaminés PBS dans le réservoir. Lorsque vous avez terminé, si l&#39;on travaille avec du matériel infectieux, ajouter de désinfectant DMQ à PBS dans le réservoir et laisser reposer quelques minutes avant de retirer. Eliminer décontaminés PBS dans le drain. Puis rincez le réservoir avec de l&#39;eau pour enlever le sel et le désinfectant. Espace de travail propre et les ustensiles avec DMQ. Rincer les ustensiles avec de l&#39;eau. Faire des tétramères CMH biotinylé monomères: Obtenir biotinylé molécules CMH de classe I tels que HLA-A * 0201 / B 2 m / molécules peptidiques produites soit avec Gag (SLYNTVATL), Pol (ILKEPVHGV), ou sans rapport MART peptide (ELAGIGILTV) les peptides de Beckman Coulter. Biotinylé HLA-A * 0301 / B 2 m / molécules peptidiques produites soit avec Gag (KIRLRPGGK) ou NEF (QVPLRPMTYK) à l&#39;installation tétramère NIAID. Tétramères sont générés en ajoutant 6 aliquotes de FITC étiqueté ExtraAvidin (Sigma) pour biotinylé Mamu A. * 01 / B 2 m / monomères peptidiques au cours de 8 heures à un rapport molaire final de 4,5:1 Le raisonnement derrière ajoutant le extravidine est lentement que durant les points de temps au début il ya une surabondance de monomère qui assure que toutes les extravidine ajouté obtient les quatre sites biotine lié. Plus tard dans la réaction, ce processus est moins efficace car il ya moins de monomère à gauche et plus d&#39;une chance que extravidine n&#39;auront pas tous les 4 sites liés. Si elles sont ajoutées tous les extravidine à la fois la réaction serait moins efficace et plus molécules extravidine aurait seulement 2 ou 3 monomères ci-joint.

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	<li>Altman, J. D., Moss, P. A. H., Goulder, P. J. R., Barouch, D. H., McHeyzer-Williams, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li><li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues.">Cutting Edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> Journal of Immunology. 165, 617-61 (2000).</li><li>Qingsheng, L. i., Skinner, P. J., Ha, S. -. J., Duan, L., Mattila, T., Hage, A., White, C., Barber, D. L., O'mara, L., Southern, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcome+in+early+viral+infection.">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcome in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2008).</li><li>Haase, T., Haase, K., Zupancic, M., Sedgewick, G., Faust, R. A., Melroe, H., Cavert, W., Gebhard, K., Staskus, K., Zhang, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perelson+Quantitative+Image+Analysis+of+HIV-1+Infection+in+Lymphoid+Tissue.">Perelson Quantitative Image Analysis of HIV-1 Infection in Lymphoid Tissue.</a> Science. 274, 985-989 (1996).</li><li>Li, Q., Duan, L., Estes, J. D., Ma, Z. M., Rourke, T., Wang, Y., Reilly, C., Carlis, J., Miller, C. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+SIV+replication+in+resting+memory+CD4+T+cells+depletes+gut+lamina+propria+CD4+T+cells.">Peak SIV replication in resting memory CD4 T cells depletes gut lamina propria CD4 T cells.</a> Nature. 434, 1148-1152 (2005).</li><li>Li, Q. i. n. g. s. h. e. n. g., Estes, J. a. c. o. b. D., Schlievert, P. a. t. r. i. c. k. M., Duan, L. i. j. i. e., Brosnahan, A. m. a. n. d. a. J., Southern, P. e. t. e. r. J., Reilly, C. a. v. a. n. S., Peterson, M. a. r. n. i. e. L., Schultz-Darken, N. a. n. c. y., Brunner, K. e. v. i. n. G., Nephew, K. a. r. l. a. R., Pambuccian, S. t. e. f. a. n., Lifson, J. e. f. f. r. e. y. D., &amp;amp, J. o. h. n. V. C. a. r. l. i. s., Haase, A. s. h. l. e. y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycerol+monolaurate+prevents+mucosal+SIV+transmission.">Glycerol monolaurate prevents mucosal SIV transmission.</a> Nature. , (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Depuis l&#39;ARN du virus est utilisé comme marqueur pour les cellules infectées par le virus dans ce rapport, tous les réactifs avant l&#39;hybridation doit être ARNase libre. L&#39;hybridation in situ dans la procédure décrite ici a été modifié pour préserver le signal fluorescent à partir de la coloration tétramère situ. Comme le signal d&#39;radioautographic infectées par le virus-cellules détectées par hybridation in situ est à une profondeur d&#39;environ un diamètre de cellules, les sections d&#39;épaisseur utilisé pour la coloration tétramère situ doivent être recoupées dans les 5-8-micron d&#39;épaisseur des sections. Cette nouvelle technique de combiner dans tétramères situ et l&#39;hybridation in situ (ISTH) a décrit ici permet la visualisation simultanée, la cartographie et l&#39;analyse de la relation spatiale des cellules spécifiques du virus de CD8 + T et les cellules infectées cible. Cette méthode peut être appliquée pour évaluer le vaccin CD8 + T à base de cellules et dans d&#39;autres non-virus pathogène et interactions hôte. La méthode d&#39;analyse d&#39;image décrites ici peuvent également être adaptées pour étudier les relations spatiales des populations à deux cellules en interaction in situ, par exemple, nous avons récemment utilisé la procédure de cartographie centroïde dans l&#39;étude du VIH-1 transmission sexuelle dans le modèle primate non humain d&#39;immunodéficience simienne infection par le virus de macaques rhésus 6

Solutions et réactifs: <ul><li> PBS-H phosphate saline tamponnée contenant de l&#39;héparine (ou 100ug/ml 18.7U/ml) pour inhiber les RNases </li><li> Supports de culture RPMI tissus contenant de l&#39;héparine (ou 100ug/ml 18.7U/ml) pour inhiber les RNases </li><li> 4% à faible fondre agarose dans du PBS </li><li> PBS avec du sérum de chèvre normal de 2% (ou de sérum à partir d&#39;espèces dans lesquelles les anticorps fluorophore conjugué ont été faites). </li><li> PBS avec du sérum de chèvre normal et 2% Triton 0,3% X-100 </li><li> Tétramères CMH de classe I conjugué à FITC </li><li> Anti-FITC anticorps, par exemple BioDesign lapin anti-FITC </li><li> Fluorophore conjugué IgG anti-lapin qui a été fortement adsorbés croisées à d&#39;autres espèces d&#39;IgG pour une utilisation avec étiquetage multiple, par exemple, de chèvre anti-lapin-Cy3 </li><li> Fluorophore conjugué IgG anti-souris qui a été fortement adsorbés croisées à d&#39;autres espèces d&#39;IgG pour une utilisation avec de multiples étiquetage </li><li> PBS frais tamponné paraformaldéhyde à 4% </li><li> 0,01 M d&#39;urée </li><li> Glycérol / gélatine contenant 4mg/ml n-propyle gallate </li></ul> Equipements spéciaux <ul><li> Vibratome </li><li> Scalpel </li><li> Lames de rasoir </li><li> Ciseaux chirurgicaux </li><li> Loctite Colle rapide instantané set (produit # 46551) </li><li> Forceps </li><li> # 2 brosses de chameau cheveux peinture. Pouvez couper avec une lame de rasoir à l&#39;épaisseur désirée </li><li> De 24 puits à fond plat de la culture tissulaire p.ex. plaques Falcon # 353226 catalogue </li><li> Chambres de tissu </li><li> Feuille d&#39;étain </li><li> Carton dossier glisser par exemple, Fisher catalogue # 12-587-10 </li><li> Microscope confocal </li></ul> Réactifs TSI référence rapide PBS-H (tampon phosphate salin à l&#39;héparine) <ul><li> 450 ml de PBS 1X </li><li> 50 ml de PBS 1X + héparine 10X </li></ul> 1x PBS 10X + héparine <ul><li> 500 ml de PBS 1X </li><li> 500 mg d&#39;héparine en poudre (qui se trouve sur l&#39;étagère chimiques de stockage à sec) </li></ul> NGS PBS-H / 2% (sérum normal de chèvre) <ul><li> 49 ml de PBS-H dans le tube Falcon </li><li> 1 END ml (trouvés dans des aliquotes de 1 ml en -20 congélateur) </li></ul> NGS PBS-H / 2% / 0,3% de Triton X-100 <ul><li> 49 ml de PBS-H / 0,3% de Triton X-100 dans le tube Falcon </li><li> 1 END ml (trouvés dans des aliquotes de 1 ml en -20 congélateur) </li></ul> PBS-H / 0,3% de Triton X-100 <ul><li> 500 ml de PBS-H </li><li> 1,5 ml de Triton X-100 (il s&#39;agit d&#39;un liquide épais trouve sur les étagères de stockage à sec chimiques) </li></ul> 4% agarose LMP <ul><li> 2 g de poudre d&#39;agarose LMP </li><li> 50 ml de PBS </li><li> Secouer jusqu&#39;à mixte, micro-ondes jusqu&#39;à la poudre se dissout. </li></ul> GG-NPG (glycérol gélatine avec de n-propyle galate <ul><li> Placez une bouteille de gélatine dans de glycérol 50 degrés bain d&#39;eau pour faire fondre </li><li> Ajouter 0,06 g de propyl galate (qui se trouve sur l&#39;étagère Terris), bien agiter </li><li> Gardez à bain d&#39;eau, en secouant de temps en temps jusqu&#39;à dissolution. </li><li> Aliquoter dans des tubes de 1 ml (tubes brun) </li></ul> Paraformaldéhyde à 4% <ul><li> 4 g de paraformaldéhyde en poudre (qui se trouve sur le sec étagères stockage de produits chimiques) </li><li> Mettre environ 10 ml de PBS-H dans un cylindre gradué, ajouter la poudre de pf </li><li> Ajouter un peu d&#39;eau jusqu&#39;à ce volume atteint environ 70 ml </li><li> Ajoutez une goutte de NaOH. </li><li> Remuer jusqu&#39;à dissolution (habituellement environ 20-30 minutes) </li><li> Ajouter HCl jusqu&#39;à pH atteint entre 7-8. </li><li> Amener le volume à 100 ml avec de l&#39;eau. </li></ul> Urée 0,01 M <ul><li> 0,3 g d&#39;urée (qui se trouve sur le sec étagères stockage de produits chimiques) </li><li> 500 ml d&#39;eau </li></ul>

a technique to simultaneously visualize virus-specific cd8+ t cells and virus-infected cells in situ

Le nombre et les emplacements spécifiques du virus cellules T CD8 + par rapport au nombre et l&#39;emplacement de leurs cibles cellulaires infectées est pensé pour être critique dans la détermination des résultats qui vont de l&#39;autorisation d&#39;infections chroniques persistantes. Nous décrivons ici une méthode pour évaluer les relations spatiales et quantitatives entre immunitaires effectrices (E) spécifiques du virus de cellules T CD8 + et les cibles infectées (T) qui combine in situ tétramère (TSI) de coloration pour la détection spécifique du virus de cellules T CD8 + et in situ l&#39;hybridation (ISH) pour détecter les virus-ARN + cellules dans les tissus où la bataille entre les défenses immunitaires et l&#39;infection a lieu. La combinaison de la coloration IST et ISH, en abrégé l&#39;ISTH, permet la visualisation et de cartographie des emplacements des cellules immunitaires effectrices et cibles faciles et à la détermination de E: T ratios. Ces paramètres à leur tour peuvent ensuite être utilisées pour déterminer les relations entre la proximité spatiale, et le timing et l&#39;ampleur de la réponse immunitaire qui permettent de prédire les résultats en début d&#39;infection.

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A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

Une technique combinant la coloration tétramère situ et l&#39;hybridation in situ (ISTH) permet la visualisation, la cartographie et l&#39;analyse de la proximité spatiale des virus spécifiques des cellules T CD8 + à leurs infectées par le virus cibles, et la détermination des relations quantitatives entre ces effecteurs du système immunitaire et les cibles aux résultats de l&#39;infection.

Une technique pour visualiser simultanément spécifiques du virus de cellules CD8 + T et les cellules infectées In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

a-technique-to-simultaneously-visualize-virus-specific-cd8-t-cells

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Biology

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

12.0K vues.  University of Minnesota. Une technique combinant la coloration tétramère situ et l'hybridation in situ (ISTH) permet la visualisation, la cartographie et l'analyse de la proximité spatiale des virus spécifiques des cellules T CD8 + à leurs infectées par le virus cibles, et la détermination des relations quantitatives entre ces effecteurs du système immunitaire et les cibles aux résultats de l'infection.

Vidéo: A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

Regulatory T cells: Therapeutic Potential for Treating Transplant Rejection and Type I Diabetes

Les cellules T régulatrices: un potentiel thérapeutique pour traiter le rejet de greffe et de diabète de type I

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Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

Homing des cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

L&#39;isolement des cellules endothéliales valvulaires

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Test clonogénique: cellules adhérentes

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated precursors. Researchers have employed various methods of lineage labeling, such as DiI labeling1 and pressure injection of traceable enzymes2 to ascertain cell fate at later stages of development in model systems. The first fate maps in zebrafish (Danio rerio) were assembled by iontophoretic injection of fluorescent dyes, such as rhodamine dextran, into single cells in discrete regions of the embryo and tracing the labeled cell's fate over time3-5. While effective, these methods are technically demanding and require specialized equipment not commonly found in zebrafish labs. Recently, photoconvertable fluorescent proteins, such as Eos and Kaede, which irreversibly switch from green to red fluorescence when exposed to ultraviolet light, are seeing increased use in zebrafish6-8. The optical clarity of the zebrafish embryo and the relative ease of transgenesis have made these particularily attractive tools for lineage labeling and to observe the migration of cells in vivo7. Despite their utility, these proteins have some disadvantages compared to dye-mediated lineage labeling methods. The most crucial is the difficulty we have found in obtaining high 3-D resolution during photoconversion of these proteins. In this light, perhaps the best combination of resolution and ease of use for lineage labeling in zebrafish makes use of caged fluorescein dextran, a fluorescent dye that is bound to a quenching group that masks its fluorescence9. The dye can then be "uncaged" (released from the quenching group) within a specific cell using UV light from a laser or mercury lamp, allowing visualization of its fluorescence or immunodetection. Unlike iontophoretic methods, caged fluorescein can be injected with standard injection apparatuses and uncaged with an epifluorescence microscope equipped with a pinhole10. In addition, antibodies against fluorescein detect only the uncaged form, and the epitope survives fixation well11. Finally, caged fluorescein can be activated with very high 3-D resolution, especially if two-photon microscopy is employed 12,13. This protocol describes a method of lineage labeling by caged fluorescein and laser uncaging. Subsequenctly, uncaged fluorescein is detected simultaneously with other epitopes such as GFP by labeling with antibodies.

This protocol delineates a way to label and trace the fate of small groups of cells zebrafish embryos using UV-uncaging of caged fluorescein, followed by whole mount immunolabeling to amplify the signal from the uncaged fluorescein.

Étiquetage des cellules Lineage Zebrafish avec laser Uncagable dextran fluorescéine

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induction et analyse des épithéliale à mésenchymateuses transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

Coloration immunofluorescente in situ de l&#39;autophagie dans les cellules souches musculaires

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study insulin granule exocytosis either use electrophysiology or microscopy coupled to the expression of fluorescent reporters. However most of these techniques have been optimized for clonal cell lines or require dissociating pancreatic islets. In contrast, the method presented here allows for real time visualization of insulin granule exocytosis in intact pancreatic islets. In this protocol, we first describe the viral infection of isolated pancreatic islets with adenovirus that encodes a pH-sensitive green fluorescent protein (GFP), pHluorin, coupled to neuropeptide Y (NPY). Second, we describe the confocal imaging of islets five days after viral infection and how to monitor the insulin granule secretion. Briefly, the infected islets are placed on a coverslip on an imaging chamber and imaged under an upright laser-scanning confocal microscope while being continuously perfused with extracellular solution containing various stimuli. Confocal images spanning 50 &#181;m of the islet are acquired as time-lapse recordings using a fast-resonant scanner. The fusion of insulin granules with the plasma membrane can be followed over time. This procedure also allows for testing a battery of stimuli in a single experiment, is compatible with both mouse and human islets, and can be combined with various dyes for functional imaging (e.g., membrane potential or cytosolic calcium dyes).

We describe a protocol for visualization of insulin exocytosis in intact islets using pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein. Isolated islets are infected with adenovirus encoding pHluorin coupled to the vesicle cargo neuropeptide Y. This allows for the detection of insulin granule fusion events by confocal microscopy.

Confocale, imagerie du Neuropeptide Y-pHluorin : une Technique pour visualiser l’insuline granules cytotoxiques dans les îlots murins et humains intacts

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...