Agradecemos a los Dres. Yuh-Nung Jan y Grueber Wes para proporcionar poblaciones de moscas utilizadas en este estudio. Los autores agradecen la F. Thomas y Kate Miller Jeffress Memorial Trust para el apoyo de esta investigación (DNC) y la Oficina de la Universidad George Mason Provost (EPRI).

Comentarios generales sobre clasificación magnética de bolas de Drosophila neuronas periféricas (El tiempo total para la conclusión del Protocolo: 2.5-3 horas) Procedimientos estándar de laboratorio para el mantenimiento de un medio ambiente limpio, libre de ARNasa deben ser observadas en todo momento para evitar la degradación del ARN. Cuando la cutícula larval de Drosophila se diseca y se coloca en el buffer de disociación celular, las neuronas periféricas son una de las celdas última a desprenderse de la cutícula. Hemos explotado esta propiedad y diseñado este protocolo para eliminar la mayoría de las células no específicas de la cutícula, como el músculo y la grasa antes de aislar las neuronas da. Con la práctica, todo el protocolo puede ser completado con éxito dentro de aproximadamente 2,5 horas. La preparación de cuentas recubiertas de anticuerpos debe ser completado antes de que el experimento comienza. 1. La preparación de partículas magnéticas de las células Encuadernación: Este paso debe ser completado antes del inicio del experimento. Las cuentas preparadas pueden ser preparadas y almacenadas a 4 º C hasta que se necesite. <ol><li> Lavado de 100 l de Dynabeads M-280 bolas recubiertas de estreptavidina tres veces en PBS por resuspensión en 500 l de PBS y granulación en un campo magnético fuerte cada vez. </li><li> Finalmente volver a suspender las cuentas directamente en 100 l de puro rata con biotina de anticuerpos anti-ratón-CD8a (concentración de anticuerpos es de 100 ug / ml). </li><li> Incubar la mezcla durante 1 hora en hielo con agitación ocasional leve para evitar la sedimentación. [1 l de Dynabeads M-280 se puede obligar a 0,05-0,10 mg de anticuerpos con biotina]. </li><li> Lave la mezcla de grano de anticuerpos tres veces como se describe en el paso 1.1 para eliminar el exceso de anticuerpos. Las bolas magnéticas están recubiertas con anticuerpos y listo para ser utilizado. Guarde la mezcla de bolas de anticuerpos en 100 l de PBS 1X a 4 º C hasta su uso. </li></ol> 2. Selección y lavado de larvas: (10-15 minutos) <ol><li> Elige misma edad 30-50 larvas de tercer estadio y colocarlos en un tubo de microcentrífuga con 1,6 ml de fosfato de 1 a 1,2 ml 1X solución salina (PBS). (3-5 minutos) </li><li> Cerrar el tubo y agitar en el que el valor máximo tres veces durante 1 segundo cada uno. </li><li> El uso de un pulido al fuego pipeta Pasteur de descartar el sobrenadante por completo. Repita el lavado (2.1) y agitar (2,2) los pasos 3-4 veces hasta que el sobrenadante es visiblemente libres de cualquier partícula de alimentos y residuos. </li><li> Brevemente repetir el lavado con 1 ml de etanol al 70% y descartar el sobrenadante. </li><li> Lave las larvas dos veces con 1 ml de H 2 Odd y descartar el sobrenadante. </li><li> Brevemente repetir el lavado de nuevo con 1 ml de RNasa-AWAY y descartar el sobrenadante. </li><li> Lavado de las larvas de tres veces en 1 ml de ddH2O para asegurar la eliminación completa de la RNasa-AWAY. </li></ol> 3. Disección: (10-12 minutos) <ol><li> Coloque 10-12 larvas en el centro de una placa de 35 mm recubierto Sylgard Petri. Posición a un poco de distancia el uno del otro. [Paso Crítico: Desechar cualquier larva que no parecen estar en la etapa de desarrollo apropiada] </li><li> Corte el extremo anterior de las larvas con un par de tijeras de disección fina de todas las larvas. </li><li> Con un par de aburridos Dumont N º 5 pinzas de invertir las larvas de dentro a fuera. Insertar una pinza en el interior de la cutícula larval todo el camino hasta el extremo posterior. Apriete la punta de la pinza en conjunto para agarrar el extremo posterior de la cutícula (Figura 1a) (prueba a pulsar la cutícula hacia abajo en la superficie Sylgard para hacer más fácil). Usando el segundo par de pinzas, empuje la cutícula larval de adentro hacia afuera. [Paso Crítico: Trate de practicar este método un par de veces antes de intentar el experimento de aislamiento de células. Trate de obtener las larvas completamente invertido, para asegurarse de que todos los tejidos blandos están expuestos a la solución para facilitar la disociación.] </li><li> Después de la disección de las larvas de 3-4, trasladarlos de inmediato a frescas, helado de PBS (se coloca el tubo en hielo) en un tubo de microcentrífuga de 1,6 ml. </li><li> Repita los pasos 3,1 a 3,4 hasta que todas las larvas requieren son recogidos (larvas de 30-40 en este protocolo). [Paso Crítico:. Anticipar 10-20% de pérdida durante la disección y la disociación, y planificar en consecuencia] </li></ol> 4. La eliminación de baja adherencia no específica las células: (2-3 minutos) [Este paso ayuda a la limpieza de baja adherencia no tejidos específicos, tales como cuerpos grasos y el SNC.] <ol><li> Tome el tubo de 1,6 ml de microcentrífuga que contiene la cutícula larval invertida y sustituir el sobrenadante con aproximadamente 700 a 800 l de agua dulce helado de PBS. </li><li> Pulse-vórtice del tubo de microcentrífuga 5 veces (3 segundos por pulso) a toda velocidad. </li><li> Descartar el sobrenadante y reemplazarlo con aproximadamente 700-800 l fresco, helado de PBS. </li><li> Repita los pasos 4,2 y 4,3 veces tres. </li><li> Resuspend la cutícula larval en 400 l de agua dulce, helado de PBS </li></ol> 5. Disociar el tejido en una suspensión de células individuales: (18-20 minutos) [Paso Crítico: Más de disociación puede causar la pérdida del marcador de superficie celular que conduce a producir células pobres y la viabilidad celular baja. El tejido de las larvas se pueden disociar, ya sea mecánica disociación (ultrasonidos, douncing), la disociación enzimática (tripsina, colagenasa, etc) o una combinación de ambos. A medida que estos tejidos larvarios son difíciles de disociar, se encontró que una combinación de mecánica y enzimática disociación dado los mejores resultados.] <ol><li> Añadir 1,5 l de Liberase 1X Blendzyme 3 (28 W nsch unidades / vial) a la cutícula larval suspendieron en 400 l de PBS. </li><li> Vortex la solución 2-3 veces durante 1 segundo cada uno en posición máxima (Esto debería eliminar las células de baja adherencia de la cutícula en la solución). </li><li> Incubar la solución a temperatura ambiente (22-25 ° C) durante 5 minutos. [Paso crítico: el tiempo de incubación afecta en gran medida la eficiencia de las células de clasificación final. El tiempo de incubación recomendado debería ser suficiente para aflojar el tejido. No exceda de 15 minutos.] </li><li> Pulse-vórtice del tubo de 20-30 veces en la configuración máxima de 2 segundos por pulso a toda velocidad. Esto debería libera el tejido muscular y otros en la solución. Inspeccionar una pequeña muestra de la solución bajo un microscopio de fluorescencia estéreo en cada paso. (Con la experiencia de uno debe ser capaz de determinar el grado de disociación al observar el tubo de microcentrífuga directamente bajo una fluorescencia permitió estéreo-microscopio) </li><li> Lave la cutícula larval 2-3 veces con agua dulce, helado de PBS y finalmente se resuspenden en 500 l de BSA frescas, helado de PBS con 1%. </li><li> Para evitar la cutícula larval se pegue a la superficie de cristal del triturador de tejidos 2 ml Kontes y mano gran distancia, antes de cubrir el triturador de tejidos y mortero con una BSA al 1% en solución de PBS y después de un breve enjuague descartar la solución de BSA. Posteriormente, utilizando una pipeta Pasteur pulida al fuego, la transferencia de las cutículas del paso 5.5 al triturador de tejidos recubiertos con BSA. [Paso Crítico: Pre-enfriar el triturador de tejidos / mortero, colocándolo en hielo durante unos minutos para prevenir el daño celular / lisis]. </li><li> Dounce el tejido con movimientos lentos y firmes, para evitar formación de espuma (aproximadamente 20 a 30 golpes). [Paso Crítico:. Dounce lenta y constante, de lo contrario, las células pueden lisar] </li><li> Para evaluar los niveles de células disociación, limpie la pared exterior del triturador de tejidos con un pañuelo limpio Kimwipe, e inspeccionar debajo de un fluorescente estereomicroscopio. Las neuronas que se han desprendido de la cutícula, y se puede ver en la solución. Si esto resulta ser difícil, en su defecto pipeta una pequeña muestra de la solución, y observarlo bajo un microscopio estereoscópico fluorescente. Un buen indicador de disociación celular es la ausencia de las neuronas de la cutícula larval. Sin embargo, si uno sigue observando las neuronas unido a la cutícula, u observa las células incompletamente disociado, Dounce más hasta que las células lograr una suspensión de células individuales. </li><li> Triturar la solución 5 veces con una pipeta Pasteur pulida al fuego redujo a aproximadamente el 50% del diámetro de la punta estándar, seguido de 10 veces con una pipeta Pasteur pulida al fuego redujo a aproximadamente el 25% del diámetro de la punta estándar. [Paso Crítico: trituración enérgica puede dañar las células. Monitor de las células entre los pasos, y ajustar el procedimiento de acuerdo]. </li><li> Filtrar la solución a través de un filtro de 30 micras de células y recoger el celular filtrado en un tubo de microcentrífuga de 1,6 ml. La solución resultante debe consistir en una suspensión de células individuales y ya está listo para la clasificación de células magnéticas. </li></ol> 6. Clasificación magnética celular bolas: (45 - 75 minutos, depende del tiempo de incubación de anticuerpos) <ol><li> Añadir 15 l de anticuerpos magnéticas recubiertas con 500 l de suspensión celular (paso 5,10). El resto de anticuerpos magnética cuentas conjugado puede ser almacenado hasta que sea necesario para aislamientos celulares siguientes. </li><li> Se incuban las células con anticuerpos magnéticas recubiertas por 30-60 minutos en hielo con ocasionales mezcla manual. [Paso Crítico: La incubación a una temperatura más alta o más tiempo puede dar lugar a la unión de anticuerpos no específicos.] </li><li> Coloque el tubo de microcentrífuga en un fuerte campo magnético durante 2 minutos. Todas las células seleccionadas positivamente con cuentas no consolidadas se separará a un lado del tubo. </li><li> Poco a poco pipeta el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento celular. </li><li> Lavar las células 3-4 veces en agua dulce, helado de PBS para eliminar cualquier resto de células no específicas. </li><li> Resuspender las células en 30 l de agua dulce, helado de PBS. </li><li> Para aproximar la pureza y el rendimiento de las células, pipeta de 5 l de la susp celularension sobre la superficie pulida de un hemocitómetro y contar todas las células fluorescentes visibles bajo el microscopio estereoscópico fluorescente. También puedes ver la cantidad de células no fluorescentes y cualquier signo de impurezas. Normalmente, la muestra será altamente enriquecido para fabricar células fluorescentes. </li></ol> 7. Aislamiento del ARN de las células de bolas magnéticas Ordenado: (60 - 75 minutos) <ol><li> Después de contar, que sedimenten las células en un campo magnético, descartar el sobrenadante y añadir 20 l de tampón de extracción de la PicoPure ™ de aislamiento de ARN Kit (Molecular Devices). Dependiendo del número de células que se pueden necesitar para añadir un mayor volumen de tampón de extracción. </li><li> Vórtice del tubo a la máxima velocidad para permitir la mezcla de pellet de células con tampón de extracción. </li><li> Incubar el tubo a 42 ° C durante 30 minutos. </li><li> Para asegurar la eliminación de las partículas magnéticas antes de la purificación de columna de la ARN (véase el paso 7.5), el tubo se centrifuga brevemente a 2.000 (x) g durante 2 minutos para que sedimenten las partículas magnéticas. El tubo se coloca en un campo magnético fuerte para retener el sedimento y el sobrenadante se transfiere a un tubo de microcentrífuga nuevo. </li><li> Extraer y purificar la columna ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante PicoPure extracción de RNA kit. DNasa tratamiento es opcional, y se puede realizar en la columna durante la purificación de ARN de acuerdo con el requisito de análisis. Por último, eluir el ARN unido total en un volumen pequeño (11-30 l) de tampón de elución y almacenar a -80 ° C hasta que esté listo para su uso. Si se desea una alícuota de 1 l se puede utilizar para evaluar la calidad total de ARN en un Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.). </li></ol> Los resultados representativos: Clasificación de esferas magnéticas se utilizó para aislar las neuronas da Drosophila (Figura 1). El ARN purificado a partir de estas neuronas aisladas da (Figura 2a) se encontró que era de excelente calidad, como se indica por la presencia de fuerte 5.8S, 18S y 28S del RNA ribosomal picos cuando se analiza en un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) ( Figura 2b). A partir de las larvas de tercer estadio 30-40 que éramos capaces de aislar a un promedio de 300-500 IV clase neuronas da con el controlador de PPK-GAL4 y 1500-2000 neuronas da (Clase I, II, III y IV) con la pan- da específica de neuronas GAL4 21-7 conductor. Para evaluar el enriquecimiento neuronal específica de las células aisladas se realizó cuantitativos transcripción reversa PCR (QRT-PCR) utilizando dos genes específicos de marcadores neuronales (elav y futsch). Estos análisis revelaron un importante enriquecimiento veces de genes marcadores que indican tanto un enriquecimiento muy específico para las neuronas da en comparación con el flujo mediante el uso de nuestro protocolo (Figura 3). Finalmente, el ARN aislado de los pan-da neuronas y de clase IV neuronas da se utilizó para realizar perfiles de expresión transcripcional de Agilent Drosophila melanogaster todo el genoma de microarrays oligo (4 x 44K) (Figura 4). Estos análisis identificó numerosos reguladores anteriormente implicados de la morfogénesis da neurona dendrita, además de un amplio espectro de moléculas previamente caracterizados y de supuestas vías de transducción de señal que potencialmente desempeñan importantes funciones en el desarrollo da la neurona. Estudios diseñados para evaluar el papel potencial (s) de estas moléculas no caracterizado previamente en la mediación da el desarrollo de las neuronas, las dendritas y morfogénesis en concreto, están actualmente en curso. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure1tmb.jpg" border="0" /> Figura 1:. Esquema de clasificación de bolas magnéticas de Drosophila neuronas da (a) emparejados por edad larvas de tercer estadio que lleva el da neuronal específica GAL4, UAS-mCD8-GFP reportero transgén son disecados mediante la inversión de la cutícula larval de adentro hacia fuera, para exponer la PNS a la disociación de amortiguación y almacenarse en helado de PBS. (b) la disociación enzimática se lleva a cabo mediante la adición de Liberase Blendzyme 3 a la solución que contiene la cutícula larval. (c) Los tejidos de las larvas son más disociado por una combinación de agitación, trituración y douncing para eliminar de forma no específica tejidos etiquetados como grasa cuerpos, intestino y sistema nervioso central. (d, e), las células se filtra utilizando un filtro de 30 micras de células. La solución contiene una única suspensión de células de diferentes tipos de células incluyendo epitelio, músculo y las neuronas. (F) Anti-ratón-CD8a recubiertas de anticuerpos Dynabeads M-280 se añaden a la suspensión celular, y se incubaron en hielo durante 30-60 minutos. ( g) Las partículas magnéticas se une a las neuronas que se da a un ratón que expresan CD8 etiquetado proteína GFP de fusión. (h, i) La bola recubierta de células magnético se separan mediante la colocación de la solución en un fuerte campo magnético. Se desecha el sobrenadante y las células se lavan tres veces para eliminar cualquier residuo no específicos de las células, dando lugar a (j) highly poblaciones purificadas de neuronas DA. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure1.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure2tmb.jpg" border="0" /> Figura 2: (a) representante de la imagen positiva seleccionados, GFP fluorescentes de clase IV neuronas da aisladas por disociación celular y la clasificación de cuentas magnéticas. La población resultante de las neuronas se determinó que era altamente enriquecido para la clase IV neuronas da con poca o ninguna célula impurezas contaminantes. (B) Un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) electroferograma de ARN total aislado de perlas magnéticas ordenados neuronas DA , mostrando una excelente calidad de ARN total como se indica por la presencia de 5.8S, 18S, 28S y ARNr. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure2.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 2. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure3.jpg" border="0" /> Figura 3: QRT-PCR análisis de la expresión del gen marcador neuronal en neuronas aisladas da (GAL421-7, UAS-mCD8-GFP) y el flujo a través de la fracción se realizó por triplicado. Los niveles de expresión de los dos genes marcadores neuronales específicos (elav y futsch) fueron evaluados por QRT-PCR. Los valores obtenidos de estos análisis se normalizaron con el control endógeno (rp49), y los niveles relativos a los observados en el flujo a través de la fracción se calcula utilizando el método ΔΔCτ 6. Ambos elav y futsch se enriquecieron de manera significativa en la aislada población de neuronas da en comparación con el flujo a través de la fracción. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure4tmb.jpg" border="0" /> Figura 4: Representante de la Clase IV-da neuronal específica Cy3 etiquetado de archivos de imagen de microarrays. Aquí se muestra un Agilent Drosophila melanogaster todo el genoma-oligo microarrays (4 x 44K) hibridado con Cy3-labeld ARN total aislado de la clase IV neuronas da purificado por la clasificación de cuentas magnéticas. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure4.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 4.

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	<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+methods.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li></ol>

El protocolo que aquí se presenta ha sido optimizado para el aislamiento y purificación de las neuronas periféricas, que se adhieren firmemente a la superficie interna de la Drosophila cutícula tercer estadio larval con un cordón magnético de la estrategia de clasificación de células. A pesar de que han utilizado este protocolo para aislar específicamente Drosophila neuronas da, la aplicación de este protocolo para el aislamiento de otros tipos de células que se adhieren a la cutícula de las larvas o pupas d...

Equipo <ul><li> (10) imanes de neodimio de bloque (K &amp; J Magnetics, Inc., cat. # B444B), en su defecto dynamag ™ 2 (Invitrogen, cat. # 123-21D) puede ser utilizado. </li><li> Glass Kontes tejido Grinder, 2 ml de capacidad de trabajo, con su correspondiente mano gran distancia (Cat. # 885300-0.002) </li><li> Filtros de la célula, por ejemplo, MACS Pre-filtro de separación (Miltenyi Biotec, cat. # 130-041-407) </li><li> 35 mm placas petri cubiertas con Sylgard (Dow Corning Corporation, cat. # 3097358 a 1.004) </li><li> Herramientas de disección: dos pares de pinzas Dumont N º 5 (Herramientas Artes Ciencia, Cat # 11251-20). </li><li> Vannas primavera microdisección tijeras (Herramientas Artes Ciencia, cat. # 15000 a 08) </li><li> Pipetas (P-1000, P-100, P-10) con puntas desechables </li><li> Hemocitómetro estándar para contar las células y la pureza de estimación </li><li> Pipetas Pasteur con puntas pulidas al fuego de diámetro estándar, se redujo a aproximadamente el 50% del diámetro normal y reducido a ~ 25% del diámetro estándar para la trituración </li><li> Para la mesa de microcentrífuga (1-16,000 (x) g) </li><li> Vórtice </li><li> Fluorescentes estereomicroscopio (a MZ16FA Leica fue utilizada en este protocolo) </li></ul>

isolation and purification of drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting

La<em&gt; Drosophila</em&gt; Del sistema nervioso periférico (SNP) es un poderoso modelo para la investigación de los complejos procesos de desarrollo neuronal y la morfogénesis de las dendritas a nivel funcional y molecular. Para ayudar en estos análisis, hemos desarrollado una estrategia para el aislamiento de una subclase de las neuronas PNS llamada arborización dendrítica (da), las neuronas que han sido ampliamente utilizados para el estudio de la morfogénesis dendrita<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Estas neuronas son muy difíciles de aislar en una población pura, debido en parte a su ocurrencia muy baja y su-difícil de alcanzar ubicación por debajo de la cutícula larval dura de quitina. Nuestro nuevo método supera estos desafíos, y se basa en una celda de enriquecimiento rápido y específico mediante anticuerpos recubiertos con partículas magnéticas. Para nuestros estudios magnéticos clasificación de cuentas, hemos utilizado la misma edad larvas de tercer estadio que expresa una proteína del ratón CD8 etiquetado de fusión GFP (<em&gt; UAS-GFP-mCD8</em&gt;)<sup&gt; 3</sup&gt; Bajo el control de cualquiera de la arborización dendrítica de clase IV (da) neuronal específica<em&gt; Carterista (PPK)-GAL4</em&gt; Conductor<sup&gt; 4</sup&gt; O el control de la pan-da neuronal específica GAL4<sup&gt; 21-7</sup&gt; Conductor<sup&gt; 5</sup&gt;. Aunque este protocolo ha sido optimizado para aislar las células PNS que se unen a la pared interna de la cutícula de las larvas, mediante la variación de algunos parámetros, el mismo protocolo que podría ser utilizado para aislar diferentes tipos de células adjunta a la cutícula en las etapas de larva o pupa desarrollo (por ejemplo, epitelios, muscular, etc oenocytes), u otros tipos de células de los órganos de las larvas dependiendo del modelo de driver GAL4 expresión específica. El ARN aislado por este método es de alta calidad y puede ser fácilmente utilizada para posteriores análisis genómico, tales como estudios de microarrays perfiles de expresión génica. Este enfoque ofrece una nueva y poderosa herramienta para llevar a cabo estudios sobre el aislamiento<em&gt; Drosophila</em&gt; Arborización dendrítica (da), las neuronas lo que proporciona nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares subyacentes a la morfogénesis de dendritas.

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Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

En este video-artículo se presenta un método para el aislamiento y purificación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuronas periféricas con una rápida estrategia de asistencia con bolas magnéticas clasificación de células. ARN obtenido a partir de las células aisladas pueden ser fácilmente utilizada para aplicaciones posteriores incluyendo el análisis de microarrays.

Aislamiento y purificación de Drosophila Clasificación de las neuronas periféricas por bolas magnéticas

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

13.3K vistas.  George Mason University. En este video-artículo se presenta un método para el aislamiento y purificación de Drosophila Neuronas periféricas con una rápida estrategia de asistencia con bolas magnéticas clasificación de células. ARN obtenido a partir de las células aisladas pueden ser fácilmente utilizada para aplicaciones posteriores incluyendo el análisis de microarrays.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Investigación

Biología

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

El aislamiento de Drosophila melanogaster Testículos

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Aislamiento y purificación de Kinesin desde Drosophila Los embriones

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Aislamiento de la cromatina mediante la purificación de ARN (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their prominent presence is often associated with poor prognosis1,2. CAFs are an activated subpopulation of stromal fibroblasts, many of which express the myofibroblast marker &alpha;-SMA3. CAFs originate from local tissue fibroblasts as well as from bone marrow-derived cells recruited into the developing tumor and adopt a CAF phenotype under the influence of the tumor microenvironment4. CAFs were shown to facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes tumor cell proliferation, angiogenesis, and invasion5-8. We demonstrated that CAFs enhance tumor growth by mediating tumor-promoting inflammation, starting at the earliest pre-neoplastic stages9. Despite increasing evidence of the key role CAFs play in facilitating tumor growth, studying CAFs has been an on-going challenge due to the lack of CAF-specific markers and the vast heterogeneity of these cells, with many subtypes co-existing in the tumor microenvironment10. Moreover, studying fibroblasts in vitro is hindered by the fact that their gene expression profile is often altered in tissue culture11,12 . To address this problem and to allow unbiased gene expression profiling of fibroblasts from fresh mouse and human tissues, we developed a method based on previous protocols for Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)13,14. Our approach relies on utilizing PDGFR&alpha; as a surface marker to isolate fibroblasts from fresh mouse and human tissue. PDGFR&alpha; is abundantly expressed by both normal fibroblasts and CAFs9,15 . This method allows isolation of pure populations of normal fibroblasts and CAFs, including, but not restricted to &alpha;-SMA+ activated myofibroblasts. Isolated fibroblasts can then be used for characterization and comparison of the evolution of gene expression that occurs in CAFs during tumorigenesis. Indeed, we and others reported expression profiling of fibroblasts isolated by cell sorting16. This protocol was successfully performed to isolate and profile highly enriched populations of fibroblasts from skin, mammary, pancreas and lung tissues. Moreover, our method also allows culturing of sorted cells, in order to perform functional experiments and to avoid contamination by tumor cells, which is often a big obstacle when trying to culture CAFs.

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Cancer Associated Fibroblasts (CAFs) facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes proliferation, angiogenesis, and inflammation. Here we describe a method to isolate pure populations of normal fibroblasts and CAFs from fresh mouse and human tissues by cell sorting, using PDGFR&#x03B1; as a surface marker.

Aislamiento de fibroblastos normales y el cáncer asociado-de los tejidos frescos por Clasificación células activadas por fluorescencia (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Purificación de las transcripciones y los metabolitos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Cabezales

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

La identificación de la interacción proteína-proteína en<em&gt; Drosophila</em&gt; Jefes adultas por Tandem Affinity purificación (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Aislamiento rápido y purificación de mitocondrias para el trasplante por disociación de tejidos y filtración diferencial

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Aislamiento y caracterización de microvesículas de la sangre periférica

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

Clasificación celular activada por fluorescencia para el aislamiento de las poblaciones celulares escleractinianas

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...