Ringraziamo Drs. Yuh-gen Nung e Wes Grueber per la fornitura di scorte di volo utilizzato in questo studio. Gli autori riconoscono la F. Thomas e Kate Miller Jeffress Memorial Trust per il supporto di questa ricerca (DNC) e l&#39;Ufficio George Mason University Provost (EPRI).

Commenti generali su Magnetic Ordinamento Bead della Drosophila neuroni periferici (Timing totale per il completamento del protocollo: 2,5-3 ore) Procedure standard di laboratorio per il mantenimento di un ambiente pulito e libero RNAse devono essere osservate in ogni momento per evitare la degradazione dell&#39;RNA. Quando la cuticola larvale Drosophila viene sezionato e posto nel buffer di dissociazione delle cellule, i neuroni periferici sono una delle celle ultima a staccarsi dalla cuticola. Abbiamo sfruttato questa proprietà e progettato questo protocollo per rimuovere la maggior parte dei non-specifico le cellule dalla cuticola come il muscolo e grasso prima di isolare i neuroni da. Con la pratica, il protocollo intero può essere completato con successo nel giro di circa 2,5 ore. La preparazione di perline legate agli anticorpi devono essere completate prima che l&#39;esperimento comincia. 1. Preparazione Perline magnetica per celle Rilegatura: Questo passaggio deve essere completato prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento. Le perle preparato possono essere preparati e conservati a 4 ° C fino al momento. <ol><li> Lavare 100 ml di Dynabeads M-280 beads Streptavidin ricoperto per tre volte in PBS da resuspending in 500 ml di PBS fresco e cubettatura è in un forte campo magnetico ogni volta. </li><li> Infine risospendere le sfere direttamente in 100 ml di anticorpi di ratto non diluito biotinilato anti-topo-CD8a (concentrazione di anticorpi è 100 mg / ml). </li><li> Incubare la miscela per 1 ora su ghiaccio con occasionali vortex da lieve a evitare la sedimentazione. [1 ml di Dynabeads M-280 può legare 0,05-0,10 mg di anticorpo biotinilato]. </li><li> Lavare il tallone-anticorpo miscela tre volte come descritto al punto 1.1 per rimuovere l&#39;anticorpo in eccesso. Le sfere magnetiche sono rivestiti con anticorpo e pronto per essere utilizzato. Conservare il cordone-anticorpo miscela in 100 ml di PBS 1X a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol> 2. Selezione e lavaggio Larve: (10-15 minuti) <ol><li> Scegli stessa età 30-50 larve terzo instar e metterli in una provetta per microcentrifuga 1.6ml con 1-1,2 ml di 1X Phosphate Buffered Saline (PBS). (3-5 minuti) </li><li> Tappare la provetta e vortice che al valore massimo tre volte per 1 secondo ciascuna. </li><li> Utilizzando un incendio lucidato pipetta Pasteur scartare il surnatante completamente. Ripetere il lavaggio (2,1) e vortex (2,2) passi 3-4 volte fino a quando il surnatante è visibilmente chiaro di particelle di cibo e detriti. </li><li> Brevemente ripetere il lavaggio con 1 ml di etanolo al 70% e scartare il surnatante. </li><li> Lavare le larve due volte con 1 ml di ddH2O e scartare il surnatante. </li><li> Brevemente ripetere il lavaggio, ancora una volta con 1 ml di RNAsi-AWAY e scartare il surnatante. </li><li> Lavare le larve tre volte in 1 ml di ddH2O per assicurare la rimozione completa di RNAsi-AWAY. </li></ol> 3. Dissezione: (10-12 minuti) <ol><li> Luogo 10-12 larve al centro di un piatto rivestito Sylgard 35 millimetri Petri. Posizione leggermente distanza gli uni dagli altri. [Punto Critico: Eliminare qualsiasi larve che non sembrano essere al momento opportuno di sviluppo] </li><li> Taglio aperto la punta anteriore delle larve con un paio di forbici dissezione bene per tutte le larve. </li><li> Utilizzando un paio di sordo Dumont n ° 5 pinze invertire le larve dentro-fuori. Inserire una pinza all&#39;interno della cuticola larvale fino alla fine posteriore. Pizzicare la punta delle pinze insieme per afferrare l&#39;estremità posteriore della cuticola (Figura 1a) (provate a premere la cuticola sulla superficie Sylgard per rendere più facile). Utilizzando la seconda coppia di pinze, spingere le cuticole larvali dentro e fuori. [Punto Critico: Prova pratica di questo metodo un paio di volte prima di tentare l&#39;esperimento di isolamento delle cellule. Cercare di ottenere le larve completamente invertito, per garantire che tutti i tessuti molli sono esposti a una soluzione per una facile dissociazione.] </li><li> Dopo la dissezione larve 3-4, trasferirli immediatamente a fresco, ghiacciato PBS (posizionare il tubo in ghiaccio) in una provetta da microcentrifuga 1,6 ml. </li><li> Ripetere i passaggi 3,1-3,4 fino a che tutte le larve richiesti sono raccolti (30-40 larve in questo protocollo). [Fase critica:. Anticipare la perdita di 10-20% durante la dissezione e la dissociazione, e pianificare di conseguenza] </li></ol> 4. Rimozione di vagamente aderente non specifiche cellule: (2-3 minuti) [Questa fase aiuta la compensazione di vagamente aderente non specifici tessuti come corpi grassi e del SNC.] <ol><li> Prendere la microcentrifuga 1,6 ml tubo contenente le cuticole invertita larvale e sostituire il surnatante con circa 700-800 ml di fresca ghiacciata PBS. </li><li> Pulse-vortice nella provetta per microcentrifuga 5 volte (3 secondi per impulso) a piena velocità. </li><li> Eliminare il supernatante e sostituirlo con circa 700-800 microlitri fresca, ghiacciata PBS. </li><li> Ripetere i passi 4.2 e 4.3 per tre volte. </li><li> Resuspend le cuticole larvali in 400 ml di fresco, ghiacciato PBS </li></ol> 5. Dissociare il tessuto in una sospensione singola cella: (18-20 minuti) [Punto Critico: Over-dissociazione può causare la perdita della superficie cellulare marcatore porta alla produzione di cellule poveri e vitalità cellulare basso. Il tessuto larvale può essere dissociata da una dissociazione meccanica (sonicazione, douncing), dissociazione enzimatica (tripsina, collagenasi, ecc) o una combinazione di entrambi. Poiché questi tessuti larvali sono difficile dissociare, abbiamo scoperto che una combinazione di entrambi meccanica e dissociazione enzimatica ha dato i migliori risultati.] <ol><li> Aggiungere 1,5 ml di Liberase Blendzyme 1X 3 (28 W unità nsch / fiala) per la cuticola larvale sospesi in 400 ml di PBS. </li><li> Vortex la soluzione 2-3 volte per 1 secondo ciascuno al valore massimo (Questo dovrebbe rimuovere le cellule aderenti liberamente dalla cuticola nella soluzione). </li><li> Incubare la soluzione a temperatura ambiente (22-25 ° C) per 5 minuti. [Punto Critico: I tempi di incubazione influenza notevolmente l&#39;efficienza finale separazione delle cellule. Il tempo di incubazione raccomandato dovrebbe essere sufficiente per allentare il tessuto. Non superare i 15 minuti.] </li><li> Pulse-vortice del tubo 20-30 volte con impostazioni al massimo per 2 secondi per impulso a tutta velocità. Questo dovrebbe rilascia i muscoli e altri tessuti nella soluzione. Ispezionare un piccolo campione dalla soluzione sotto un fluorescente stereo-microscopio ad ogni passo. (Con l&#39;esperienza si dovrebbe essere in grado di determinare il livello di dissociazione osservando la provetta da microcentrifuga direttamente sotto una fluorescenza abilitato stereomicroscopio) </li><li> Lavare le cuticole larvali 2-3 volte fresca, ghiacciata PBS e infine li risospendere in 500 ml di fresca, ghiacciata BSA PBS contenente 1%. </li><li> Per evitare la cuticola larvale attaccarsi alla superficie del vetro del 2 ml tessuto Kontes macina e il pestello spazio di grandi dimensioni, pre-coat la smerigliatrice tessuti e pestello con una BSA 1% in soluzione PBS e dopo un breve risciacquo scartare la soluzione di BSA. Successivamente, utilizzando un incendio lucidato pipetta Pasteur, trasferire le cuticole dal punto 5.5 al BSA rivestite grinder tessuti. [Fase critica: Pre-raffreddare la smerigliatrice tessuto / pestello ponendolo in ghiaccio per qualche minuto per evitare danni alle cellule / lisi]. </li><li> Dounce il tessuto con tratti lento e costante, evitando la formazione di schiuma (circa 20-30 colpi). [Punto Critico:. Dounce lentamente e costantemente, altrimenti le cellule possono lisare] </li><li> Per valutare i livelli di cellule dissociazione, pulire il muro esterno della smerigliatrice tessuto con un tessuto Kimwipe pulire ed esaminare sotto un fluorescente stereo-microscopio. I neuroni dovrebbe avere staccato dalla cuticola, e può essere visto nella soluzione. Se questo si trova ad essere difficile, in alternativa pipetta da un piccolo campione della soluzione, e osservare sotto un fluorescente stereo-microscopio. Una buona indicazione di cellula dissociazione è l&#39;assenza di neuroni dalla cuticola larvale. Tuttavia, se si osserva ancora i neuroni attaccati alla cuticola, o osserva le cellule non completamente dissociato, dounce ulteriormente fino a quando le cellule ottenere una sospensione singola cellula. </li><li> Triturare la soluzione 5 volte con un incendio lucidato pipetta Pasteur ridotto a circa il 50% del diametro della punta standard, seguito da 10 volte con un fuoco lucidato pipetta Pasteur ridotto a circa il 25% del diametro della punta standard. [Punto Critico: triturazione Forceful possono danneggiare le cellule. Monitorare le cellule tra i passaggi, e regolare la procedura di conseguenza]. </li><li> Filtrare la soluzione attraverso un filtro a 30 micron cellulari e raccogliere le cellule filtrato in una provetta da microcentrifuga 1,6 ml. La soluzione risultante deve essere costituito da una sospensione singola cellula ed è ora pronto per l&#39;ordinamento delle cellule magnetica. </li></ol> 6. Magnetici Ordinamento Bead Cell: (45 - 75 minuti, dipendente dal tempo di incubazione degli anticorpi) <ol><li> Aggiungere 15 ml di anticorpi sfere rivestiti magnetico a 500 l di sospensione cellulare (punto 5.10). I restanti anticorpi coniugati perline magnetiche possono essere conservati fino al momento della cella di isolamento successive. </li><li> Incubare le cellule con anticorpi sfere rivestiti magnetico per 30-60 minuti in ghiaccio con occasionali miscelazione manuale. [Fase critica: incubazione ad una temperatura più alta o più a lungo tempo può causare legame aspecifico degli anticorpi.] </li><li> Collocare la provetta da microcentrifuga in un forte campo magnetico per 2 minuti. Tutte le cellule positivamente selezionato insieme con perline legato separerà al lato del tubo. </li><li> Lentamente pipetta il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet. </li><li> Lavare le cellule 3-4 volte in acqua dolce, ghiaccio, freddo PBS per rimuovere qualsiasi residuo non specifiche cellule. </li><li> Risospendere le cellule in 30 ml di fresco, ghiacciato PBS. </li><li> Per approssimare la purezza e la resa delle celle, pipettare 5 ml di sosp della cellulaENSIONE sulla superficie levigata di un emocitometro e contare tutte le cellule fluorescenti visibili sotto un fluorescente stereo-microscopio. Anche controllare la quantità di cellule non fluorescente e tutti i segni di impurità. In genere il campione sarà fortemente arricchito per le cellule fluorescenti. </li></ol> 7. Isolamento RNA da cellule magnetica Bead ordinato: (60 - 75 minuti) <ol><li> Dopo il conteggio, agglomerare le cellule in un campo magnetico, scartare il surnatante e aggiungere 20 ml di tampone di estrazione dal ™ PicoPure RNA Isolation Kit (Molecular Devices). A seconda del numero di cellule che si possano desiderare per aggiungere un maggiore volume di tampone di estrazione. </li><li> Vortex il tubo alla massima velocità per consentire la miscelazione di pellet con tampone di estrazione. </li><li> Incubare la provetta a 42 ° C per 30 minuti. </li><li> Per assicurare la rimozione degli sfere magnetiche prima colonna purificazione del RNA (vedi punto 7.5), il tubo viene brevemente centrifugata a 2.000 (x) g per 2 minuti per far sedimentare le sfere magnetiche. Il tubo viene quindi posto in un forte campo magnetico per mantenere il pellet, e il supernatante è trasferito in una provetta da microcentrifuga nuovo. </li><li> Estrarre e purificare l&#39;RNA colonna secondo le istruzioni del produttore estrazione PicoPure RNA kit. DNAsi trattamento è facoltativo, e può essere eseguita su colonna durante la purificazione di RNA secondo le esigenze di analisi. Infine, eluire l&#39;RNA totale legato in un piccolo volume (11-30 mL) di tampone di eluizione e conservare a -80 ° C fino al momento dell&#39;utilizzo. Se lo si desidera un 1 microlitri aliquota può essere utilizzato per valutare la qualità totale RNA su un Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.). </li></ol> Rappresentante dei risultati: Magnetici ordinamento cordone è stato utilizzato per isolare Drosophila da neuroni (Figura 1). L&#39;RNA purificato da questi neuroni isolati da (Figura 2a) è risultato essere di ottima qualità, come indicato dalla presenza di forte 5.8S, 18S e 28S picchi di RNA ribosomiale se analizzato su un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) ( Figura 2b). A partire da 30-40 larve terzo instar siamo stati capaci di isolare in media 300-500 classe IV neuroni da utilizzando il PPK-GAL4 driver e 1500-2000 da neuroni (Classe I, II, III e IV) con il pan- da neurone specifico GAL4 21-7 driver. Per valutare l&#39;neuronali specifici per l&#39;arricchimento delle nostre cellule isolate abbiamo eseguito trascrizione inversa PCR quantitativa (QRT-PCR) utilizzando due neuronale gene-specifici marcatori (ELAV e futsch). Queste analisi hanno rivelato significativo arricchimento piega di entrambi i geni marker che indica un arricchimento altamente specifico per i neuroni da rispetto al fluire attraverso usando il nostro protocollo (Figura 3). Infine, l&#39;RNA isolato da entrambi i pan-da neuroni e di classe IV da neuroni è stato utilizzato per eseguire il profiling trascrizionale dell&#39;espressione su Agilent Drosophila melanogaster intero genoma oligo microarray (4 x 44K) (Figura 4). Queste analisi hanno identificato numerosi regolatori precedentemente implicato della morfogenesi da neurone dendrite oltre ad un ampio spettro di molecole in precedenza e non caratterizzato putativo vie di trasduzione del segnale che potenzialmente svolgono importanti ruoli funzionali in fase di sviluppo da neurone. Studi volti a valutare il ruolo potenziale (s) di queste molecole non caratterizzato in precedenza nella mediazione da sviluppo dei neuroni, e specificamente la morfogenesi dendriti, sono attualmente in corso. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure1tmb.jpg" border="0" /> Figura 1:. Schematica di smistamento magnetico goccia di Drosophila neuroni da (a) Età abbinati larve terzo instar porta il neurone specifico da GAL4, UAS-mCD8-GFP giornalista transgene sono sezionati invertendo la cuticola larvale inside-out, per esporre la PNS di dissociazione del buffer e conservati in ghiaccio PBS freddo. (b) dissociazione enzimatica è realizzato con l&#39;aggiunta Liberase Blendzyme 3 per la soluzione contenente cuticola larvale. (c) I tessuti larvali sono ulteriormente dissociato da una combinazione di vortex, triturazione e douncing per rimuovere i tessuti non specificamente etichettati come grassi corpi, intestino e sistema nervoso centrale. (d, e) Le cellule sono poi filtrati con un filtro da 30 micron cellula. La soluzione contiene un&#39;unica sospensione cellulare di diversi tipi di cellule tra cui epiteli, muscoli e neuroni. (F), anti-topo CD8a-anticorpi Dynabeads M-280 sono aggiunti alla sospensione cellulare, e incubate in ghiaccio per 30-60 minuti. ( g) Le sfere magnetiche si lega ai neuroni che esprimono da un mouse CD8 tag proteina di fusione GFP. (h, i) Le cellule del cordone magnetico rivestito sono separati ponendo la soluzione in un forte campo magnetico. Il supernatante viene scartato, e le cellule vengono lavate tre volte per rimuovere eventuali residui non specifica delle cellule, con conseguente (j) highly purificato da popolazioni di neuroni. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure1.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure2tmb.jpg" border="0" /> Figura 2: (a) immagine rappresentativa del positivamente selezionato, fluorescente GFP classe IV neuroni da cellule isolate dalla dissociazione e magnetici ordinamento tallone. La popolazione risultante di neuroni è stato considerato altamente arricchito per la classe IV da neuroni con poca o nessuna impurità cellule contaminanti. (B) Un Bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies, Inc.) elettroferogramma di RNA totale isolato da perla magnetica neuroni ordinati da , mostrando un ottimo rapporto qualità RNA totale, come indicato dalla presenza di 5.8S, 18S e 28S rRNA. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure2.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 2. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure3.jpg" border="0" /> Figura 3: qRT-PCR dell&#39;espressione neuronale gene marcatore in isolate da neuroni (GAL421-7, UAS-mCD8-GFP) e il flusso attraverso la frazione è stata eseguita in triplice copia. I livelli di espressione dei due neuronali specifici geni marcatori (ELAV e futsch) sono stati valutati da qRT-PCR. I valori ottenuti da queste analisi sono stati normalizzati al controllo endogeno (rp49), ed i livelli rispetto a quelli osservati in flusso attraverso frazione sono stati calcolati con il metodo ΔΔCτ 6. Sia ELAV e futsch erano significativamente arricchito in isolati popolazione da neurone rispetto al flusso attraverso la frazione. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure4tmb.jpg" border="0" /> Figura 4: Rappresentante di classe IV da neuroni specifici Cy3 etichettati file immagine microarray. Qui è un Agilent Drosophila melanogaster intero genoma oligo microarray (4 x 44K) ibridato con Cy3-labeld RNA totale isolato dalla classe IV neuroni da purificata dalla magnetica ordinamento tallone. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure4.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 4.

<ol>
	<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+methods.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li></ol>

Il protocollo presentato qui è ottimizzato per l&#39;isolamento e la purificazione dei neuroni periferici che aderiscono strettamente alla superficie interna della cuticola terzo Drosophila instar larvale con una perla magnetica strategia di separazione delle cellule. Mentre abbiamo usato questo protocollo per isolare specificamente Drosophila neuroni da applicazioni di questo protocollo per l&#39;isolamento di altri tipi di cellule che aderiscono alla cuticola in stadi larvali o pupe di sviluppo (per esempio epiteli, ...

Attrezzatura <ul><li> (10) blocco magneti al neodimio (Magnetics K &amp; J, Inc., cat. # B444B), in alternativa DynaMag ™ -2 (Invitrogen, cat. N. 123-21D), può essere utilizzato. </li><li> Kontes Grinder tessuto di vetro, 2 ml di lavoro, con pestello spazio di grandi dimensioni (Cat. # 885300-0002) </li><li> Filtri di cellule, ad esempio, MACS pre-filtro di separazione (Miltenyi Biotec, cat. # 130-041-407) </li><li> 35 millimetri petri-piatti rivestiti con Sylgard (Dow Corning Corporation, cat. # 3097358-1004) </li><li> Strumenti di dissezione: due paia di pinzette Dumont n. 5 (Strumenti Scienza Fine, Cat # 11251-20). </li><li> Vännäs primavera micro-dissezione forbici (Strumenti Scienze Arti, cat. # 15000-08) </li><li> Pipette (P-1000, P-100, P-10) con punte monouso </li><li> Emocitometro standard per contare le cellule e la purezza stima </li><li> Pipette Pasteur con punte fuoco lucido di diametro standard, ridotto a circa il 50% del diametro standard e ridotto a ~ 25% del diametro standard per la triturazione </li><li> Piano micro-centrifuga (1-16,000 (x) g) </li><li> Vortice </li><li> Fluorescente stereo-microscopio (un MZ16FA Leica è stato utilizzato in questo protocollo) </li></ul>

isolation and purification of drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting

Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Sistema nervoso periferico (PNS) è un modello potente per indagare i complessi processi di sviluppo neuronale e morfogenesi dendrite a livello funzionale e molecolare. Per facilitare queste analisi, abbiamo sviluppato una strategia per l&#39;isolamento di una sottoclasse di neuroni PNS chiamato arborizzazione dendritica (bis) i neuroni che sono stati ampiamente utilizzati per studiare la morfogenesi dendrite<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Questi neuroni sono molto difficili da isolare come una popolazione pura, dovuto in parte al loro verificarsi estremamente bassa e la loro difficile da raggiungere, posizione sotto la cuticola chitinosa dura larvale. Il nostro metodo di nuova concezione supera queste sfide, e si basa su un arricchimento delle cellule veloce e specifici utilizzando sfere magnetiche legate agli anticorpi. Per i nostri studi magnetici ordinamento tallone, abbiamo usato pari età larve terzo instar esprimere un mouse CD8 tag proteina di fusione GFP (<em&gt; UAS-mCD8-GFP</em&gt;)<sup&gt; 3</sup&gt; Sotto il controllo sia della arborizzazione dendritica classe IV (bis)-neurone specifico<em&gt; Borseggiatore (PPK)-GAL4</em&gt; Autista<sup&gt; 4</sup&gt; O il controllo del pan-da neuroni specifici GAL4<sup&gt; 21-7</sup&gt; Autista<sup&gt; 5</sup&gt;. Anche se questo protocollo è stato ottimizzato per isolare le cellule PNS che sono attaccati alla parete interna della cuticola larvale, variando alcuni parametri, il protocollo di poter essere utilizzata per isolare molti tipi cellulari diversi collegato alla cuticola a stadi larvali o pupe di sviluppo (per esempio epiteli, muscolo, oenocytes ecc), o altri tipi di cellule di organi larvale a seconda della GAL4 specifico modello di driver di espressione. L&#39;RNA isolato con questo metodo è di alta qualità e può essere facilmente utilizzata per analisi genomiche a valle, come gli studi di espressione genica profiling microarray. Questo approccio offre un nuovo e potente strumento per svolgere studi di isolati<em&gt; Drosophila</em&gt; Arborizzazione dendritica (bis) i neuroni fornendo così nuove intuizioni sui meccanismi molecolari alla base della morfogenesi dendrite.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting at JoVE.com

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In questo video-articolo vi presentiamo un metodo per l&#39;isolamento e la purificazione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni periferici utilizzando un digiuno perla magnetica assistita strategia di separazione delle cellule. RNA ottenuti da cellule isolate possono essere facilmente utilizzato per applicazioni a valle comprese le analisi di microarray.

Isolamento e purificazione di Drosophila Neuroni periferici da Magnetic Ordinamento Bead

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

isolation-purification-drosophila-peripheral-neurons-magnetic-bead

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

13.3K Views.  George Mason University. In questo video-articolo vi presentiamo un metodo per l'isolamento e la purificazione di Drosophila Neuroni periferici utilizzando un digiuno perla magnetica assistita strategia di separazione delle cellule. RNA ottenuti da cellule isolate possono essere facilmente utilizzato per applicazioni a valle comprese le analisi di microarray.