Los autores desean agradecer la asistencia de la Sra. Sue Connell por su experiencia en la incrustación de resina y tumbas Sra. Stephania por su experiencia de laboratorio. Los autores desean agradecer al profesor Frank Kandziora y la Dra. Marie-Anne Polboth por sus consejos.

<ol><li> El tejido se coloca en un recipiente sellado que contiene un 10% de tampón fosfato solución de formalina al 3. Garantizar una mínima exposición a la luz, si el análisis fluorocromo se va a realizar, como los fluorocromos son sensibles a la luz. </li><li> Establecer que la orientación de los tejidos será necesario. </li><li> Desbastar la muestra con el tamaño, la orientación correcta, usando una sierra de cinta. Garantizar las medidas de seguridad se cumplen. La muestra se coloca en un recipiente opaco, el volumen de lo que debe ser de aproximadamente diez veces el tamaño de la muestra para lograr una adecuada fijación. El espécimen debe permanecer en la solución de formalina un total de entre una y dos semanas dependiendo de su tamaño. Se sugiere el uso de tejido de control para fines de prueba y optimización. </li><li> Compruebe que el tejido se ajusta al molde y coloque la incorporación de tejido en un recipiente sellado opaco que contiene 70% de etanol. </li><li> Proceso de tejido en forma ascendente las concentraciones de etanol, protección de la luz y con agitación constante. <ol class="lalpha"><li> Etanol al 70% una semana </li><li> Etanol al 80% una semana </li><li> 90% de etanol 1 semana </li><li> Etanol al 100% una semana </li></ol></li><li> El tejido se borra en butanol durante 1 semana, de nuevo blindaje de la luz y con agitación constante. </li><li> La densidad de la resina y el hueso debe ser muy igualados. La densidad de la resina se puede modificar (consulte el paso 8) y se recomienda incorporar un primera muestra de análisis para asegurar la densidad correcta. Usamos Technovit 7100 (Heraeus Kulzer) para microscopía óptica y análisis fluorocromo. Si inmunohistoquímica se requiere una resina de alternativas debe ser utilizado como Technovit 9100 (Heraeus Kulzer). </li><li> La preparación de la solución Technovit 7100 puede ser mezclado con pequeñas partes alícuotas de la solución de ablandamiento suministrado con el kit, si es necesario, pero a no más de 5% el volumen de la preparación de la solución, en nuestra experiencia, la solución de ablandamiento es requerido en raras ocasiones. Partes iguales de etanol absoluto y Technovit base líquida de 7100 se mezclan y se aplica a los tejidos como una solución pre-infiltración durante 24 horas, se minimiza la exposición de luz y con agitación. </li><li> La solución de infiltración se hace entonces usando un endurecedor g I (= 1 bolsa) que se disuelve en 100 ml de líquido de base. Esto reemplaza la solución pre-infiltración y se le permite infiltrarse durante 1 semana en agitación constante. </li><li> Coloque el tejido en el molde, con la cara de superficie de corte hacia abajo. Asegurarse de que existe un margen (lo ideal es al menos 5 milímetros) en todo el tejido de la resina, lo que garantiza la fuerza del bloque. Mix 15mls de solución Technovit preparación 7100 con 1 ml de endurecedor II y verter alrededor de espécimen en el molde y se cubre por lo menos 5 millimietres. El curado se iniciará a las 2 horas, pero será completa durante la noche. </li><li> A continuación se realiza el montaje de configuración de un bloque de apoyo con Technovit 3040 (Heraeus Kulzer). Mix Technovit 3040 en una proporción de volumen de 2 partes de polvo por parte de líquido 1 para obtener un líquido viscoso. Vierta Technovit 3040 en el hueco en la parte posterior del bloque a un nivel de al menos 2 mm por encima de la base del bloque. Después de 10 minutos el molde puede ser desprendido y el bloque está listo. </li><li> La densidad y por lo tanto las propiedades de corte de resina de metacrilato son susceptibles a la humedad del ambiente en la habitación. Por lo tanto, los bloques deben ser almacenados en un desecador. </li><li> Seccionamiento del suelo produce grandes secciones de 20-50 micrómetros de espesor. Es útil para el análisis de fluorocromo (véase la sección siguiente) como las secciones más gruesas producen fluorescencia más brillante. Asegure la cuchilla de diamante para macrotome. Agregue lubricante, como el espíritu de petróleo a la reserva en el macrotome. Asegure el bloque de la pinza y orientar a la hoja. Permiten moler a ocurrir lentamente (aproximadamente 20-30 minutos por sección) asegurar una lubricación adecuada. La primera sección expone la cara de corte y orienta la sección-que debe ser desechada. </li><li> La siguiente sección se coloca en un portaobjetos Superfrost Plus. El tramo tiene una tendencia a enrollarse por lo que recomendamos colocar una porción de una bolsa de más de ella y luego mantenerla plana con otra diapositiva sujeta en su lugar. Luego se coloca en una incubadora de entre 60-80 grados Celsius durante 1 hora. Esto ablanda el metacrilato y ayuda a la sección de adherirse a la diapositiva de una manera plana. </li><li> La sección de la tierra puede ser limpiado y pulido de materiales mediante lija de grano fino de una manera suave. </li><li> El microtomo trineo cortes de secciones delgadas, que ofrece las mejores secciones de microsocopy luz. Use un microtomo trineo, ya que ha añadido la rigidez, lo que se requiere para el corte de los bloques duros. Alternativamente, un micrótomo rotatorio alimentado puede ser utilizado. Utilizar una cuchilla de acero inoxidable. Es preferible tener dos hojas a disposición como puede ser afiladas como el otro se usa. La hoja debe hacer un ángulo de 45 grados con el bloque. Suablandamiento rface se puede lograr mediante la aplicación de un papel mojado en el bloque si es necesario. Puede tomar varias secciones para lograr las condiciones de corte deseado para obtener una sección de calidad. La sección se presentó en ese entonces en un baño de agua y se coloca en una diapositiva como en el 16. </li><li> Reactivos de tinción se enumeran en los materiales a continuación. Protocolos se basan en 4 Bancroft et al. Debido a las variaciones de espesor se recomienda optimizar las manchas en los portaobjetos. Tinción bastidor puede causar que el tejido de flotar fuera de la diapositiva así que la adición de las manchas directamente a una compuerta plana puede ser requerida. Un protocolo idéntico o manchas bastidor es necesario para obtener resultados consistentes tinción necesarios para histomorfometría. <ol class="lalpha"><li> Hematoxilina y eosina <ol class="lroman"><li> Mancha con Haematoxyilin 5-10 minutos </li><li> Lavar bien con agua del grifo de Scott s </li><li> Se tiñen con eosina 5 minutos </li><li> Lavar con agua corriente </li><li> Aclarar en xileno </li><li> Montar </li><li> Resultados <ol><li> Osteoide = rosa </li><li> Hueso calcificado = marrón morado </li><li> Núcleos = azul </li></ol></li></ol></li><li> Von Kossa <ol class="lroman"><li> Lugar en la solución de nitrato de plata y exponer a la luz fuerte hasta que el hueso mineralizado se vuelve negro (aprox. 10 minutos) </li><li> Lave con agua destilada tres veces </li><li> Amenaza con tiosulfato de sodio durante 5 minutos </li><li> Lave con agua destilada </li><li> De contraste con Safrinin O </li><li> Aclarar en xileno </li><li> Montar </li><li> Resultados <ol><li> Hueso mineralizado = negro </li><li> Osteoide = rojo / rosado </li></ol></li></ol></li><li> Masson Goldner s tricrómica <ol class="lroman"><li> Lavar con alcohol alcalina (90mls de etanol al 80% y 10ml de 25% de amoníaco durante 20 minutos) </li><li> Enjuague con agua </li><li> Enjuague con agua destilada </li><li> Tinción con hematoxilina de Weigert s durante 10 minutos </li><li> Enjuague con agua destilada </li><li> Tinción con Ponceau-fucsina solución últimos 5 minutos </li><li> Enjuague con 1% de ácido acético 15 segundos </li><li> Mancha en fosfomolíbdico ácido-naranja solución G 5 minutos </li><li> Enjuague con 1% de ácido acético 15 segundos </li><li> Mancha con la luz verde 5 minutos </li><li> Enjuague con 1% de ácido acético al 3 cambios </li><li> Enjuague con agua destilada </li><li> Montar </li><li> Resultados <ol><li> Hueso mineralizado = verde </li><li> Osteoide = rojo / naranja </li><li> Núcleos = azul gris </li><li> Cartílago = púrpura </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Preparaciones fluorocromo: </li><li> Estos se administran por inyección intravenosa lenta, por lo menos dos semanas de diferencia. </li><li> Dosis <ol class="lalpha"><li> Calceína Verde 10 mg / kg IV </li><li> Oxitetraciclina 50 mg / kg IV </li><li> Alizarina complexona 30 mg / kg IV </li></ol></li><li> Preparación de calceína Verde <ol class="lalpha"><li> Un gramo de calceína Verde se titula con NaOH 1 M hasta que se disuelva. </li><li> pH se ajusta con un 1% NaOH hasta pH = 7.1-7.2. </li><li> Filtro y mantener a salvo de la luz </li></ol></li><li> Preparación de alizarina complexona <ol class="lalpha"><li> Tres gramos de alizarina complexona se titula con NaOH 1 M hasta que se disuelva. </li><li> pH se ajusta con un 1% HCl o NaOH hasta pH = 7.1-7.2. </li><li> Filtro y mantener a salvo de la luz </li></ol></li><li> Preparación de oxitetraciclina <ol class="lalpha"><li> Oxitetraciclina está disponible como fuera de la plataforma anti-microbiana de drogas. No requiere preparación. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Atlas of Functional Histology. , 164-168 (2000).</li><li>Parfitt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+histomorphometry:+standardization+of+nomenclature,+symbols,+and+units.+Report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee.">Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).</li><li>An, Y. H., Martin, K. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of histology methods for bone and cartilage. , (2003).</li><li>Bancroft, J. D., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and Practice of Histological Techniques. , 352-360 (2008).</li></ol>

Disolventes: <ul><li> 10% normal formol, etanol, xileno y butanol ácido Todos los histología de grado, sin azufre. GRALE Ciencia Pty Ltd. http://www.grale.com.au </li></ul> Moldes: <ul><li> Despegue, moldes de plástico GRALE Científico </li></ul> Diapositivas: <ul><li> Superfrost Plus portaobjetos Lomb Ciencia Pty Ltd. <a href="http://www.lomb.com.au/">http://www.lomb.com.au</a> </li></ul> Resina: <ul><li> GlycolMethacrylate Technovit 7100 Heraeus Kulzer <a href="http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm">http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm</a> </li><li> Respaldo de bloques de resina Technovit 3040 bloques Histo Heraeus Kulzer </li></ul> Las manchas (Reactivos de GRALE Científica) Tricrómico de Goldner mancha </li> 1. Férrica de Weigert hematoxilina (DeGroat) <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) hematoxilina solución </td></tr><tr><td> Hematoxilina </td><td> 1g </td></tr><tr><td> El alcohol absoluto </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) Solución de Hierro </td></tr><tr><td> 30% de cloruro férrico acuoso </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> El ácido clorhídrico (concentrado) </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> agua destilada </td><td> 95mL </td></tr></table> Filtra y se añade a un volumen igual de hematoxilina inmediatamente antes de utilizar la mancha. 2. Ponceau-fucsina-azophloxin soluciones de archivo <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) Ponceau xilidina de solución </td></tr><tr><td> Ponceau de xilidina </td><td> 0,75 g </td></tr><tr><td> ácido fuchsion </td><td> 0,25 g </td></tr><tr><td> El ácido acético </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> mezclar y añadir agua destilada (100 ml) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) azophloxin solución </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 0,5 g </td></tr><tr><td> El ácido acético </td><td> 0,6 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> mezclar y añadir agua destilada (100 ml) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> c) Solución de trabajo de final de la mancha </td></tr><tr><td> Ponceau-fucsina solución </td><td> 5-10mL </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> 0,2% de solución de ácido acético </td><td> 88mL </td></tr></table> 3. Solución La luz verde <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Luz verde </td><td> 1g </td></tr><tr><td> ácido acético </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mezclar y añadir agua destilada (500 ml) </td></tr></table> 4. Phophomolybdic ácido-Orange G solución <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Fosfomolíbdico ácido </td><td> 3g </td></tr><tr><td> Orange G </td><td> 2g </td></tr><tr><td colspan="2"> Se disuelven en 500 ml de agua destilada y añadir timol cristal. </td></tr></table> Von Kossa <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> 1% de nitrato de plata acuoso </td></tr><tr><td> 2,5% de tiosulfato de sodio </td></tr><tr><td> 1% safranina O </td></tr></table> Alcian mancha azul <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Alcian blue 8GX </td><td> 1g </td></tr><tr><td> 3% de solución de ácido acético </td><td> 100 ml </td></tr></table> Hematoxilina y eosina <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) hematoxilina de Harris </td></tr><tr><td> Hematoxilina </td><td> 2.5g </td></tr><tr><td> Alcohol absoluto </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td> Alumbre de potasio </td><td> 50g </td></tr><tr><td> agua destilada </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> óxido de mercurio </td><td> 1,25 g O </td></tr><tr><td> El yodato de sodio </td><td> 0,5 g </td></tr><tr><td> Ácido acético glacial </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) Eosina solución </td></tr><tr><td colspan="2"> Eosina producidos comercialmente se utilizó. </td></tr></table> Todos los polvos colorantes mancha se Gurr polvos colorantes. Todos los reactivos son reactivos para análisis, y no reactivos de laboratorio Fluorocromos <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Fabricante </td><td> Fluorocromo </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich, Sydney </td><td> Calceína Verde </td><td> C0875 </td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich, Sydney </td><td> Alizarina complexona </td><td> A3882 </td></tr><tr><td> Intervet Australia, Victoria </td><td> Oxitetraciclina (De la droga útil a los antimicrobianos) </td><td> Nombre comercial; Engemycin 100 </td></tr></table>

undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis

Histología ósea descalcificados demuestra la microarquitectura del hueso. Muestra tanto los componentes mineralizados y celular del hueso, que proporciona información vital sobre el recambio óseo o formación y resorción ósea. Esto tiene una importancia enorme en una variedad de aplicaciones clínicas y de investigación. Se produce bellas imágenes 1 y permite técnicas tales como la evaluación y el fluorocromo histomorfometría 2. Análisis fluorocromo es una técnica donde los tintes fluorescentes que se unen al calcio se inyectan en un momento determinado punto, lo que permite la cuantificación de la cantidad de mineralización en ese momento dado. Histomorfometría es un proceso de cuantificación de hueso a nivel microscópico. Realización de la histología del hueso descalcificados es técnicamente difícil, sobre todo con ejemplares de gran tamaño. Se requiere de variaciones en la técnica de los utilizados en parafina estándar integrado histología. Este vídeo muestra el proceso de producción de las secciones de buena calidad y demuestra las dificultades técnicas y métodos con los que para superarlos. La preparación de muestras, fijación y el procesamiento se obtienen con una forma similar a otros tejidos blandos, sin embargo debido a la densidad y baja permeabilidad de los huesos mucho más tiempo de fijación y los tiempos de procesamiento se requieren, a menudo tomando durante varias semanas. Incrustación se logra utilizando un medio de soporte con una dureza similar o igual y la densidad de los huesos, tales como resinas basadas en metacrilato, pero a diferencia de la infiltración de parafina y la inclusión, este es un paso irreversible. Seccionamiento se puede lograr mediante molienda que produce una sección más gruesa, lo cual es óptimo para los estudios como el análisis de fluorocromo. Esto se logra mejor usando una cuchilla de diamante en una macrotome. Por otra parte, las secciones más finas pueden ser producidos por microscopía de luz y esto se logra utilizando un micrótomo de trineo con una cuchilla muy afilada. El microtomo trineo ofrece la mayor resistencia y estabilidad necesaria para los bloques grandes y duras. Resina incrustada secciones se pueden teñir con una variedad de manchas, que se demuestran.

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Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

Histología ósea descalcificados proporciona información importante para una variedad de aplicaciones clínicas y de investigación. Es un desafío técnico, sobre todo con ejemplares de gran tamaño. Este vídeo muestra el proceso de producción de las secciones de buena calidad y demuestra las dificultades técnicas y métodos con los que para superarlos.

Preparación ósea descalcificados para histología, histomorfometría y Análisis Fluorocromo

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides ...

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Research

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Biology

27.1K vistas.  Monash University. Histología ósea descalcificados proporciona información importante para una variedad de aplicaciones clínicas y de investigación. Es un desafío técnico, sobre todo con ejemplares de gran tamaño. Este vídeo muestra el proceso de producción de las secciones de buena calidad y demuestra las dificultades técnicas y métodos con los que para superarlos.

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The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Investigación

Biología

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A neuronales y astrocitos Co-cultivo de ensayo para el análisis de alto contenido de neurotoxicidad

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

ARN<em&gt; In situ</emHibridación&gt; Los embriones en todo el montaje y la histología de células Adaptado para elasmobranquios marinos

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing bone, they also support the complex process of bone regeneration. This favorable behavior of autografts is attributed to the three characteristics: osteoconductivity, osteogenicity, and osteoinductivity. However, there is another aspect: Bone grafts release a myriad of molecules, including growth factors, which can target mesenchymal cells involved in bone regeneration. The paracrine properties of bone grafts can be studied in vitro by the use of bone-conditioned medium (BCM). Here we present a protocol on how to prepare bone-conditioned medium from native pig cortical bone, and bone that underwent thermal processing or demineralization. Cells can be directly exposed to BCM or seeded onto biomaterials, such as collagen membranes, previously soaked with BCM. We give examples for in vitro bioassays with mesenchymal cells on the expression of TGF-&#946; regulated genes. The presented protocols should encourage to further reveal the paracrine effects of bone grafts during bone regeneration and open a path for translational research in the broad field of reconstructive surgery.

We describe here how to prepare bone-conditioned medium (BCM) and test its activity in vitro.

Bone Medium acondicionado: Preparación y Bioensayo

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Preparación de muestras para análisis de masas Citometría

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty (TKA) is a common surgical intervention. Experiments using primary human OA tissues obtained from TKA provide the capability to investigate disease mechanisms ex vivo. While OA was previously thought to impact mainly the cartilage, it is now known to impact multiple tissues in the joint. This protocol describes patient selection, sample processing, tissue homogenization, RNA extraction, and quality control (based on RNA purity, integrity, and yield) from each of seven unique tissues to support disease mechanism investigation in the knee joint. With informed consent, samples were obtained from patients undergoing TKA for OA. Tissues were dissected, washed, and stored within 4 h of surgery by flash freezing for RNA or formalin fixation for histology. Collected tissues included articular cartilage, subchondral bone, meniscus, infrapatellar fat pad, anterior cruciate ligament, synovium, and vastus medialis oblique muscle. RNA extraction protocols were tested for each tissue type. The most significant modification involved the method of disintegration used for low-cell, high-matrix, hard tissues (considered as cartilage, bone, and meniscus) versus relatively high-cell, low-matrix, soft tissues (considered as fat pad, ligament, synovium, and muscle). It was found that pulverization was appropriate for hard tissues, and homogenization was appropriate for soft tissues. A proclivity for some subjects to yield higher RNA integrity number (RIN) values than other subjects consistently across multiple tissues was observed, suggesting that underlying factors such as disease severity may impact RNA quality. The ability to isolate high-quality RNA from primary human OA tissues provides a physiologically relevant model for sophisticated gene expression experiments, including sequencing, that can lead to clinical insights that are more readily translated to patients.

Primary tissues obtained from patients following total knee arthroplasty provide an experimental model for osteoarthritis research with maximal clinical translatability. This protocol describes how to identify, process, and isolate RNA from seven unique knee tissues to support mechanistic investigation in human osteoarthritis.

Recolección de tejidos y extracción de ARN de la articulación de la rodilla osteoartrítica humana

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Un ensayo de quimiotaxis mejorado para la identificación rápida de quimioatrayentes rizobacterianos en exudados radiculares

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...

Implantes de cartílago artificial para la regeneración ósea mediante osificación endocondral

Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it does not have a mechanism to induce angiogenesis. Implanting artificial cartilage tissue fabricated from MSCs induces angiogenesis and bone formation in vivo via endochondral ossification (ECO). Therefore, this ECO-mediated approach may be a promising bone regeneration therapy in the future. An important aspect of the clinical application of this ECO-mediated approach is establishing a protocol for preparing enough cartilage to be implanted to repair the bone defect. It is especially not practical to design a single mass of grafted cartilage of a size that conforms to the shape of the actual bone defect. Therefore, the cartilage to be transplanted must have the property of forming bone integrally when multiple pieces are implanted. Hydrogels may be an attractive tool for scaling up tissue-engineered grafts for endochondral ossification to meet clinical requirements. Although many naturally derived hydrogels support MSC cartilage formation in vitro and ECO in vivo, the optimal scaffold material to meet the needs of clinical applications has yet to be determined. Hyaluronic acid (HA) is a crucial component of the cartilage extracellular matrix and is a biodegradable and biocompatible polysaccharide. Here, we show that HA hydrogels have excellent properties to support in vitro differentiation of MSC-based cartilage tissue and promote endochondral bone formation in vivo.

Autor destacado: Mejora de la regeneración ósea con la integración de cartílago artificial vascularizado 

Bone therapy via endochondral ossification by implanting artificial cartilage tissue produced from mesenchymal stem cells has the potential to circumvent the drawbacks of conventional therapies. Hyaluronic acid hydrogels are effective in scaling up uniformly differentiated cartilage grafts as well as creating integrated bone with vascularization between fused grafts in vivo.

Formación ósea integrada a través de la osificación endocondral in vivo utilizando células madre mesenquimales

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it ...