Me gustaría dar las gracias a los muchos estudiantes universitarios que han trabajado en mi laboratorio y ha contribuido a la evolución de estos protocolos. NAT ha recibido el apoyo de la Red de Skidmore-Union, un proyecto creado con un avance NSF PAGADO subvención.

I. Total RNA montaje hibridación in situ en los elasmobranquios marinos 1. Fijación embrión y Preparación <ol><li> Skate embriones pueden organizarse de acuerdo a Ballard 7. Etapas óptimo para la detección de la expresión génica depende del tejido de interés. Para el seguimiento de la expresión génica en el tracto digestivo del patín, etapas 27-30 son óptimas 7. </li><li> Diseccionar embriones en PBS, la separación de los embriones desde el saco vitelino. </li><li> Fijar en 30 ml de paraformaldehído al 4% recién hecho (PFA) en un tubo cónico de 50 ml a 4 º C con agitación suave. Fijar durante 24 horas. </li><li> Lavar los embriones en PBT, dos veces durante 15 min, rotando a temperatura ambiente. Todas las recetas de solución para montaje ARN total in situ &#39;s se incluyen (Tabla 1). </li><li> Deshidratar embriones por lavado en una serie de metanol de 25%, 50% y 75% de metanol: PBT balanceo a temperatura ambiente. La duración de los lavados depende de la etapa de los embriones. Para pre-neurulation etapas embriones, 5 min de cada lavado en la serie de metanol es suficiente. Para los embriones de más de 30 etapas, lavado puede durar hasta 30 minutos. Para determinar si los embriones son suficientemente penetrado y aclimatarse a cada lavado, mantenga el tubo en posición vertical en la mano. Si los embriones se hunden hasta el fondo del tubo, entonces está listo para el siguiente lavado. Si los embriones flotan en la parte superior de la solución, cambie la solución y repita que etapa de deshidratación particular. </li><li> Lavar dos veces en 100% de metanol durante 10 min agitando suavemente. </li><li> Una vez deshidratado a 100% de metanol, los embriones deben ser almacenados a -20 ° C durante al menos 24 horas antes de proceder con el protocolo. Los embriones han sido correctamente almacenados a -20 ° C y se utiliza para los montajes de ARN enteros de hasta 1 año. </li></ol> 2. Síntesis de ARN sonda <ol><li> Generar un fragmento lineal de los genes cuya expresión se quiere detectar. Esto se puede hacer ya sea mediante amplificación por PCR o linealizando un plásmido con el gende interés. Para amplificar por PCR, elegir cebadores cuyos sitios de unión flanquean el gen insertar y retener los sitios de unión de ARN polimerasa en la región amplificada. Para plásmidos comúnmente usados ​​tales como PBS o pGEM, hacia adelante M15 y cebadores inversos son ideales. Alternativamente, linealizar un plásmido por digestión de 15 l de ADN de QIAGEN miniprep con una enzima que escinde en el extremo 5 &#39;del gen. Gel extraer y purificar usando el kit QIAquick apropiado. </li><li> Transcribir inversamente la sonda de ARN usando 8 ng l de plásmido lineal o 100 de producto de PCR como una plantilla mediante la ARN polimerasa apropiada (véase la Tabla 2 para la reacción de transcripción). </li><li> Incubar reacción de transcripción inversa durante 2 horas a 37 ° C. </li><li> Para confirmar reacción, ejecutar 1 l de la reacción de transcripción en un 1% de agarosa / TAE gel. Corra el gel a 100 mVolts hasta que el colorante acaba de correr en el gel. Una banda prominente solo debe ser visible. El fragmento de ADN plantilla lineal puede ser débilmente visible en un molecu mayorlar peso. </li><li> Añadir 1 l de RNasa libre de DNasa I a la reacción de transcripción y se incuba a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Para precipitado, añadir 100 ml de TE pH 8, 10 l LiCl 4 M, 300 l 100% de EtOH y se incuba a -20 ° C durante al menos 60 minutos o durante la noche. </li><li> Centrifugado durante 10 min en una microcentrífuga de 4 º C a 14.000 rpm. </li><li> Lave pellet con EtOH 70% y secar al aire. </li><li> Resuspender sonda de ARN en 20 l de H 2 O. Añadir 80 l de tampón de hibridación (tampón de hibridación debe ser pre-calentado a 70 ° C). La sonda puede ser almacenado en tampón de hibridación 80% durante varios meses a -20 ° C o más, a -80 ° C. </li></ol> 3. Embrión Pre-tratamiento y la hibridación <ol><li> Eliminar embriones almacenados en 100% de metanol a partir de -20 ° C. Para los más pequeños embriones continúe con el paso (3,2). Para más tarde en escena etapa embriones (29/30 &lt;) puede ver una capa de la epidermis que ha &#39;levantado&#39; fuera del cuerpo del embrión. Bajo el microscopio, cuidadosamente dissejar la capa epidérmica para maximizar la penetración de la sonda. </li><li> Coloque los embriones en viales de centelleo de vidrio limpios. Rehidratar los embriones en la serie de metanol inversa descrito anteriormente: (75%, 50%, 25% de metanol: PBT) por meciéndose suavemente cada solución para cada 5-30 min a temperatura ambiente. Rehidratación completa con dos lavados de PBT durante 10 minutos cada uno, agitando suavemente. </li><li> Para eliminar cualquier pigmento, embriones de blanqueo con peróxido de hidrógeno al 6% en PBT durante 1 hora a temperatura ambiente, balanceo. </li><li> Eliminar el peróxido de hidrógeno por lavado tres veces en PBT, (agitación a temperatura ambiente, 10 min cada uno). </li><li> Tratar embriones con proteinasa K para permitir la penetración de la sonda durante la hibridación. La cantidad de proteinasa K y la duración del tratamiento depende del tejido que desea examinar y la edad del embrión. Tejido más superficial y los embriones más jóvenes requieren más corto y proteinasa K menos, mientras que los tejidos más profundos y más embriones requieren una mayor concentración y un tratamiento más largo time para permeabilizar completamente el embrión para la hibridación de la sonda. Por ejemplo, para detectar Shh en el endodermo visceral de embriones en estado de patín 29, 30 ug / ml de proteinasa K / PBT se incuba durante 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Rápidamente enjuague embriones en PBT para lavar proteinasa K. </li><li> Para desactivar la proteinasa K, embriones postfix con PFA al 4%, 0,2% de glutaraldehído en PBT durante 20 min, agitando suavemente. </li><li> Lavar dos veces durante 10 minutos con PBT. </li><li><ol class="lalpha"><li> Para pre-hibridación, añadir 2-3 ml de solución de hibridación precalentada a los embriones, solo lo suficiente para cubrir. Oscilar suavemente en un baño de agua caliente a 70 ° C durante 1 hr. </li><li> Para preparar la solución de hibridación, precalentar sonda de ARN a 70 º C durante 10 min y enfriar en hielo. Diluir 15-20 l de sonda de ARN a 2 ml de solución de hibridación fresco precalentado, para obtener una concentración final de 0,5-1,0 g / ml. Retire pre-Hybe y añadir diluida sonda de ARN a los embriones. Los embriones se acaba de cubrir por solución, unadd hibridación solución más si es necesario. Tapa bien segura del vial de centelleo. Hibridan meciéndose suavemente en un baño de agua caliente a 70 ° C durante la noche. </li></ol></li></ol> 4. Publica Lava hibridación y la hibridación de anticuerpos <ol><li> Elimine la solución de hibridación con la sonda de embriones y póngalas en un vial de centelleo fresco o un tubo Eppendorf. La sonda puede ser almacenado a -20 ° C y reutilizado en el futuro. Para lavados post-hibridación, los embriones lugar en un Netwell sentado en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos. </li><li> Lavar 3 veces durante 30 minutos cada uno en pre-calentado Solución n º 1, agitación a 70 ° C. </li><li> Lavar 3 veces durante 30 minutos cada uno en pre-calentado Solución # 2, mecedora a 70 ° C. </li><li> Lavar 3 veces durante 5 min cada uno en TBST, balanceo a temperatura ambiente. </li><li> Pre-bloque con suero de oveja 10% inactivado por calor en TBST durante 1 hora, meciéndose a temperatura ambiente. </li><li> Transferencia de embriones Netwell a un vial de centelleo de vidrio fresco. Agregar anti-DIGFragmentos Fab (1:5.000) en suero de oveja 1% inactivado por calor / TBST a los embriones. Roca durante la noche a 4 ° C. </li></ol> 5. La hibridación del anuncio anticuerpos Lava <ol><li> Retire y deseche el anticuerpo. Vuelva a colocar los embriones en Netwell para lavados. </li><li> Lavar 3 veces durante 5 minutos cada uno en TBST, meciendo a temperatura ambiente </li><li> Lavar al menos 6 veces durante 1 hora cada uno, balanceo a temperatura ambiente. </li><li> Lave toda la noche en TBST, meciendo a 4 ° C. A medida que los lavados posteriores de anticuerpos ayudar a reducir la tinción de fondo, maximizando el número y la duración de los lavados es preferible. Los embriones son rutinariamente lavó en TBST a 4 º C, durante el fin de semana. </li></ol> 6. La detección de la sonda <ol><li> Maquillaje solución NTMT fresco y esterilizar por filtración. </li><li> Desechar la solución TBST lavado y embriones lugar en un vial de centelleo de vidrio limpio. Lavar 3 veces en embriones NTMT fresco durante 10 min cada uno a temperatura ambiente, balanceo. </li><li> Retire NTMT lavar y agregar la mezcla de reacciónde 1 x NBT / BCIP en 1 x NTMT. Como estos reactivos son sensibles a la luz, cubrir vial de centelleo en papel de aluminio y roca a temperatura ambiente. </li><li> Monitorear reacción de color cada 15 minutos hasta que la expresión del gen deseado es claramente visible. Sondas fuertes pueden tomar tan poco como 10 minutos para desarrollarse. Sondas débiles pueden tomar 1-2 horas. No permita que la reacción vaya por mucho tiempo o tinción de fondo comenzará a aparecer (todo el embrión comienza a tomar un color opaco púrpura o marrón). </li><li> Lavar dos veces durante 10 minutos en cada una de PBT a temperatura ambiente, balanceo. </li><li> Postfix embriones en paraformaldehído al 4%, 0,1% de glutaraldehído durante 1 hora a temperatura ambiente. Los embriones pueden ser almacenar indefinidamente en fijador a 4 º C. </li><li> Visualice embriones con un microscopio binocular de disección. Para producir una luz de fondo azul para las fotos, embriones Coloque en un plato con pre-endurecido agarosa al 1% / PBS. </li></ol> 7. Resultados representativos para Mount I. Todo el ARN de hibridación in situ en los elasmobranquios marinos Montaje ARN toda la expresión in situ &#39;s que representa de Sonic hedgehog (Shh) y HOXA13 en embriones de patín se muestra en la figura 1. La expresión de Shh en los vertebrados superiores se encuentra en la notocorda y endodermo visceral y este patrón de expresión se conserva en el patín (Figura 1a) 8,9. Elasmobranquios marinos tienen un método único de osmorregulación que utiliza la glándula rectal a las sales secretan. HOXA13 expresión es alta en el desarrollo de la glándula rectal (Figura 1b) 10. HOXA13 producto génico papel en la morfogénesis de la glándula rectal sigue siendo desconocido. II. Inclusión en parafina y seccionar los tejidos Elasmobranquios 1. Cosecha y Preparación de tejido <ol><li> Diseccionar el tejido deseado y se fijan en formalina al 10% durante 24-48 horas, meciéndose a temperatura ambiente. 4% de paraformaldehído (PFA) también puede ser utilizado como fijador(Ver Discusión). </li><li> Lavar fijador por lavado en PBS, 3 veces durante 30 minutos cada uno. Dependiendo del tamaño del tejido, tiempos de lavado se puede reducir a 10 min o mayor a 1 hr. </li><li> Deshidratar embriones por lavado en una serie de etanol de 25%, 50% y 75% de etanol: PBS balanceo a temperatura ambiente. Una vez más, el tiempo para cada lavado dependerá del tamaño del tejido. Para 0,5 cm 3 de tejido, incubar cada lavado durante 15 min. Aumentar el tiempo para grandes piezas. Si el almacenamiento a largo plazo del tejido que se desea, lavar un adicional de dos veces en etanol al 75% y almacenar a -20 ° C durante hasta un año. De lo contrario proceder al siguiente paso. </li><li> Además deshidratar por lavado 3 veces en 100% de etanol durante 15 min cada uno, balanceo. </li></ol> 2. Inclusión en parafina y seccionamiento <ol><li> Aclarar el tejido mediante el lavado 2 veces en xileno durante 5 minutos cada una en viales de centelleo de vidrio con tapas a rosca. Xileno hará que el tejido frágil, así que no excedan de un total de 10 minutos para la erahes. El tejido translúcido debe buscar cuando se lo sostiene contra la luz. Si el tejido es todavía muy opaco después de los dos lavados, hacer un lavado adicional en xileno durante 5 min y luego proceder con el protocolo. Sólo manejar xileno dentro de una campana de humos con guantes. </li><li> Retire xileno y llenar el vial de centelleo de 2/3 partes con parafina derretida. Incubar en un horno a 60 º C durante 30 min. Al poner parafina en el vial, te darás cuenta de que la parafina se solidifique a lo largo de los lados del vial. Colocar el vial en el horno y permitir que la parafina para volver a disolver durante unos minutos. Tome el vial fuera del horno y dar a la solución un remolino para mezclar rápida y sustituir en el horno durante el resto de la incubación. </li><li> Parafina Repetir dos veces más las incubaciones durante 30 min. </li><li> Incubar en parafina dos veces durante una hora cada uno. Cambiar parafina por última vez y se incuba durante la noche en la estufa a 60 º C. </li><li> El día siguiente, colocar el tejido en una cámara de parafina baño caliente y se coloca bajo vacío durante 2-3 hr. Esto facilitará la infiltración de parafina en el tejido y eliminar las burbujas de aire. Para algunos tipos de tejido delgado, un paso de vacío puede no ser necesario, pero es necesario que los embriones enteros o del tracto digestivo y otros órganos con compartimentos luminal. </li><li> Después de vacío facilita la infiltración de tejido tejido lugar, en un molde metálico con parafina derretida, y enfriar sobre una placa de hielo. Deja en hielo oa 4 ° C durante la noche antes de tratar de eliminar el tejido del molde. Los bloques de parafina de tejido pueden ser almacenadas indefinidamente a 4 ° C. </li><li> Colocar un bloque de parafina en un micrótomo y cortar secciones 8 micras. Las secciones deben ser flotados en un baño de agua a 48 ° C y se montaron en portaobjetos de vidrio Superfrost Plus *. </li><li> Diapositivas en seco durante la noche en un horno de 37 ° C. </li><li> Secciones se almacena a 4 ° C hasta su utilización. </li></ol> III. Alcian Blue / Red Fast tinción nuclear de tejido Elasmobranquios 1. Alcian Blue Stain para mucinas <ol><li> Lugar desliza hacia arriba con secciones en una diapositiva más cálido. Derretir durante 45 min. </li><li> Lugar se desliza dentro de un soporte de diapositivas. Todas las soluciones resultantes están contenidas en las tinas dentro de una campana de humos. Las diapositivas se lavan mediante la transferencia de una bañera con una solución a otra. Asegúrese de que los niveles de solución en las tinas cubre las diapositivas, los tejidos de las diapositivas están completamente sumergidos. Disolver parafina por lavado diapositivas 2 veces en xileno durante 5 min cada uno. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con 100% de etanol durante 1 min cada uno. </li><li> Rehidratar diapositivas en una serie de etanol (75%, 50%, 25% de etanol) de lavado en cada solución durante 1 min. Lave en dH 2 O durante 1 min. </li><li> Teñir con solución de Azul de Alcian, pH 2,5 durante 15 min. </li><li> Desarrollar mancha por el lavado en agua corriente durante 3 min. Sumerja una vez en dH 2 O. </li><li> Contratinción nuclear en solución rápida Contratinción Red durante 10 min. </li><li> Lavar con agua corriente durante 3 minutos y sumergir en dH 2 O la vez. </li><li> Dehymonohidrato en una serie de etanol (25%, 50%, 75%, 100%, 100%) para 20 inmersiones cada uno, o 1 min cada uno. Lavar 2 veces en xileno durante 5 min cada uno. Montar con DPX medio de montaje y cubreobjetos. Permitir medio de montaje para secar y endurecer durante 48 horas en la campana de humos antes de manipular las diapositivas. </li></ol>

<ol>
	<li>Forester, R., Goldstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+osmoregulatory+role+of+amino+acids+and+urea+in+marine+elasmobranchs.">Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs.</a> Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).</li><li>Shuttleworth, T., Shuttleworth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physiology of elasmobranch fishes. , 171-194 (1988).</li><li>Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D., Somero, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+with+water+stress:+evolution+of+osmolyte+systems.">Living with water stress: evolution of osmolyte systems.</a> Science. 217, 1214-1222 (1982).</li><li>Ballatori, N., Villalobos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+molecular+and+cellular+basis+of+toxicity+using+comparative+models.">Defining the molecular and cellular basis of toxicity using comparative models.</a> Toxicl. Appl. Pharmacol. 183, 207-220 (2002).</li><li>Nieto, M. A., Patel, K., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+analysis+of+chick+embryos+in+whole+mount+and+tissue+sections.">In situ hybridization analysis of chick embryos in whole mount and tissue sections.</a> Methods Cell Biol. 51, 219-235 (1996).</li><li>Jass, J. R., Walsh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mucin+expression+in+the+gastrointestinal+tract:+a+review.">Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review.</a> J Cell Mol Med. 5, 327-351 (2001).</li><li>Ballard, W. W., Mellinger, J., Lechenault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+for+development+of+Scyliorhinus+canicula,+the+lesser+spotted+dogfish+(Chondrichthyes;+Scyliorhinidae).">A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae).</a> J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).</li><li>Echelard, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog,+a+member+of+a+family+of+putative+signaling+molecules,+is+implicated+in+the+regulation+of+CNS+polarity.">Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity.</a> Cell. 75, 1417-1430 (1993).</li><li>Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA.">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75, 1401-1416 (1993).</li><li>Theodosiou, N. A., Hall, D. A., Jowdry, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+acid+mucin+goblet+cell+distribution+and+Hox13+expression+patterns+in+the+developing+vertebrate+digestive+tract.">Comparison of acid mucin goblet cell distribution and Hox13 expression patterns in the developing vertebrate digestive tract.</a> J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 442-453 (2007).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+7.">Ch. 7.</a> Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1, 7.82 (2001).</li><li>Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamprey+type+II+collagen+and+Sox9+reveal+an+ancient+origin+of+the+vertebrate+collagenous+skeleton.">Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li><li>Theodosiou, N. A., Simeone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+rudimentary+colon+in+the+elasmobranch,+Leucoraja+erinacea.">Evidence of a rudimentary colon in the elasmobranch, Leucoraja erinacea.</a> Dev. Genes Evol. 222, 237-243 (2012).</li><li>Filipe, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucins+in+the+human+gastrointestinal+epithelium:+a+review.">Mucins in the human gastrointestinal epithelium: a review.</a> Invest. Cell Pathol. 2, 195-216 (1979).</li><li>Corfield, A. P., Wagner, S. A., Clamp, J. R., Kriaris, M. S., Hoskins, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin+degradation+in+the+human+colon:+production+of+sialidase,+sialate+O-acetylesterase,+N-acetylneuraminate+lyase,+arylesterase,+and+glycosulfatase+activities+by+strains+of+fecal+bacteria.">Mucin degradation in the human colon: production of sialidase, sialate O-acetylesterase, N-acetylneuraminate lyase, arylesterase, and glycosulfatase activities by strains of fecal bacteria.</a> Infect. Immun. 60, 3971-3978 (1992).</li><li>Reid, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+and+histological+progression+to+malignancy+in+Barrett's+esophagus:+prospective+endoscopic+surveillance+of+a+cohort.">Flow-cytometric and histological progression to malignancy in Barrett's esophagus: prospective endoscopic surveillance of a cohort.</a> Gastroenterology. 102, 1212-1219 (1992).</li><li>Mowry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+staining+of+pancreatic+beta-cell+granules.+Evolution+and+present+status.">Selective staining of pancreatic beta-cell granules. Evolution and present status.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 107, 464-468 (1983).</li><li>Roberts, D. J., Smith, D. M., Goff, D. J., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+signaling+during+the+regionalization+of+the+chick+gut.">Epithelial-mesenchymal signaling during the regionalization of the chick gut.</a> Development. 125, 2791-2801 (1998).</li></ol>

No tengo nada que revelar.

Los protocolos presentados son métodos clásicos para el seguimiento de la expresión génica y la identificación de tipos de células diferenciadas, y se han adaptado para su uso en los elasmobranquios marinos. Las modificaciones adicionales de estos protocolos puede ser necesaria para adaptarse a las diferentes especies de elasmobranquios. La preocupación más común con respecto montaje ARN total in situ &#39;s es el riesgo de contaminación de ARNasa y de ese modo la degradac...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x transcription buffer</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11-465-384-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DIG-RNA labeling mix</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11-277-073-910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAse inhibitor</td>
 <td>Roche</td>
 <td>03-335-399-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNA polymerase - SP6</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-810-274-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNAseI, RNAse-free </td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-776-785-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Yeast RNA</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15401-029</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>EMD-Millipore</td>
 <td>220201</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>heparin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H4784</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEPC (diethyl pyrocarbonate)</td>
 <td>Research Organics</td>
 <td>2106D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Moria Perforated Spoon</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>10370-17</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Netwell inserts</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>64713-00</td>
 <td>Netwells for use in 6-well tissue culture dishes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well tissue culture plate</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass scintillation vials with screw-cap lids</td>
 <td>Weaton Science Products</td>
 <td>986540</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>formamide</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP227500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Proteinase K</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>59895 (AM2542)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NBT</td>
 <td></td>
 <td>11585029001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BCIP</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11585002001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrogen peroxide, 30%</td>
 <td>EMD</td>
 <td>HX0635-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sheep serum</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101301-478</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>glutaraldehyde</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G5882</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-109-541-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-DIG Fab Fragments</td>
 <td>Roche</td>
 <td>1137-6623</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>26323-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclear Fast Red</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>26078-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPX Mountant</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>13510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraffin (Paraplast X-tra)</td>
 <td>McCormick Scientific</td>
 <td>39503002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% Formalin, NBF</td>
 <td>VWR</td>
 <td>95042-908</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass scintillation vials with screw-cap lids</td>
 <td>Weaton Science Products</td>
 <td>986540</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steal base molds</td>
 <td>Tissue-Tek</td>
 <td>4161-4165</td>
 <td>Multiple sizes available.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cassettes </td>
 <td>Tissue-Tek</td>
 <td>4170</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slide warmer</td>
 <td>Fisher-Scientific</td>
 <td>12-594Q</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue Embedder</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>EG1160</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microtome, rotary</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>RM2235</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue-Tek Slide Staining Set</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>62540-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue-Tek 24-Slide Holder</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>62543-06</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Superfrost*Plus slides</td>
 <td>Fisherbrand</td>
 <td>12-550-17</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

rna in situ hybridization in whole mount embryos and cell histology adapted for marine elasmobranchs

Elasmobranquios marinos se valoran los modelos animales para estudios biomédicos y genómicos, ya que son los vertebrados más primitivos para tener inmunidad adaptativa y contar con mecanismos únicos para la osmorregulación 1-3. Como las más primitivas de vida jawed vertebrados con apéndices pares, los elasmobranquios son un modelo evolutivo importante, especialmente para los estudios de evolución y desarrollo. Elasmobranquios marinos también se han utilizado para estudiar toxicología acuática y la fisiología del estrés en relación a 4 sobre el cambio climático. Así, el desarrollo y la adaptación de las metodologías que se necesita para facilitar y ampliar el uso de estos vertebrados primitivos a múltiples disciplinas biológicas. Aquí os presento la exitosa adaptación de montaje ARN total hibridación in situ y técnicas histológicas para el estudio de la expresión génica y la histología de células en los elasmobranquios. Seguimiento de la expresión de genes es una herramienta de sello de desarrollo biologists, y se utiliza ampliamente para investigar los procesos de desarrollo 5. Montaje ARN toda la hibridación in situ permite la visualización y localización de transcritos de genes específicos en tejidos del embrión en desarrollo. El patrón de expresión del mensaje de un gen puede dar una idea de lo que los procesos de desarrollo y las decisiones de destino celular de un gen puede controlar. Al comparar el patrón de expresión de un gen en diferentes etapas de desarrollo, la visión puede ser adquirida en cómo el papel de algunos cambios genéticos durante el desarrollo. Mientras que todo el montaje in situ &#39;s proporciona un medio para localizar la expresión de genes a los tejidos, las técnicas histológicas permiten la identificación de tipos de células diferenciadas y tejidos. Tinciones histológicas tienen diversas funciones. Manchas generales se usan para resaltar la morfología celular, por ejemplo hematoxilina y eosina para la tinción general de núcleos y el citoplasma, respectivamente. Otras manchas pueden destacar celda específicatipos. Por ejemplo, el azul Alcian mancha presentado en este artículo es una mancha muy utilizado para identificar mucosaccharides catiónico. La tinción del tracto digestivo con azul alcián puede identificar la distribución de las células caliciformes que producen mucosaccharides. Las variaciones en los componentes mucosaccharide en péptidos cortos distinguir las células caliciformes por su función en el tracto digestivo 6. Mediante el uso de montaje ARN entero en métodos in situ &#39;s e histoquímicas simultáneamente, las decisiones de destino celular puede estar vinculado a genes específicos de expresión. A pesar de ARN in situ &#39;s e histoquímica son ampliamente utilizados por los investigadores, su adaptación y uso en los elasmobranquios marinos han tenido un éxito limitado y variados. Aquí presento protocolos desarrollados para los elasmobranquios y se utiliza de forma regular en mi laboratorio. Aunque la modificación de los ARN en el método de hibridación in situ &#39;s puede ser necesario para adaptarse a las diferentes especies, los protocolos descritos aquí proveer un sólido punto de partida para los investigadores que deseen adaptar el uso de elasmobranquios marinos para sus investigaciones científicas.

Ejemplos de tinción con azul Alcian en diferentes regiones de la L. tracto digestivo erinacea se muestra en la Figura 2. Mucina ácida que contiene células globlet son claramente visibles por el azul alcián mancha en todo el tracto digestivo. La distribución de las mucinas ácidas difiere en las diferentes regiones del tracto digestivo, lo que refleja las diferencias en la función. Mucinas ácidas están escasamente produce en el intestino espiral y cloaca, mientras que una alta c...

Watch this Scientific Journal Video about RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs at JoVE.com

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Mediante la combinación de los métodos de montaje de ARN total<em&gt; In situ</emHibridación&gt; y la histología, la expresión génica se puede vincular con las decisiones del destino celular en el embrión en desarrollo. Estos métodos han sido adaptados a los elasmobranquios marinos y facilitar el uso de estos animales como organismos modelo para estudios biomédicos, toxicología y comparativa.

ARN<em&gt; In situ</emHibridación&gt; Los embriones en todo el montaje y la histología de células Adaptado para elasmobranquios marinos

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

rna-situ-hybridization-whole-mount-embryos-cell-histology-adapted-for

Research

JoVE Journal

Biology

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

12.6K vistas.  Union College. Mediante la combinación de los métodos de montaje de ARN total In situ y la histología, la expresión génica se puede vincular con las decisiones del destino celular en el embrión en desarrollo. Estos métodos han sido adaptados a los elasmobranquios marinos y facilitar el uso de estos animales como organismos modelo para estudios biomédicos, toxicología y comparativa.

Video: RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Investigación

Biología

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Método para la tinción de anticuerpos enteros en el monte del polluelo

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Pez cebra todo el montaje de alta resolución doble fluorescente In Situ La hibridación

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Todo el montaje utilizando In situ La hibridación de Enlace de Organismos y Biología Molecular

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Todo el monte In Situ La hibridación de E8.5 a E11.5 embriones de ratón

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

La detección de ARN viral por fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Análisis de la transcripción de genes de una sola célula de ARN fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Todo el monte ARN fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta resolución todo el montaje de<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en embriones de pez cebra para estudiar la expresión génica y la función

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...