Damos las gracias al Dr. Song Yijun, y los miembros de la Hattar Kuruvilla Zhao tri-laboratorio del Departamento de Biología de la Universidad Johns Hopkins de consejo y ayuda. Apoyado por subvenciones del NIH DC007395 y DC009946.

Parte 1. La grabación EOG configuración El aparato de grabación consiste en un electrodo de registro, electrodo de referencia, el tubo de suministro de aire, la etapa de muestras, y el microscopio de disección, todos anclados en una mesa de aire dentro de una jaula de Faraday. Micromanipulador se utilizan para la colocación de los electrodos y el tubo de suministro de aire. Un flujo continuo de aire se hace pasar por agua destilada para añadir humedad antes de pasar por el tubo de aire y sobre la muestra. Un plato de cultivo de 60 mm llena de Sylgard a una profundidad de 8.6 mm se utiliza como superficie de montaje de la muestra. Un pozo y un canal están excavadas en la Sylgard en el plato de montaje para proporcionar un medio para conectar eléctricamente el electrodo de referencia de la muestra a través de la solución de Ringer modificada. El electrodo de registro y el electrodo de referencia se conecta a un amplificador. Las señales de que el amplificador se envían a un digitalizador y luego a una computadora. Software como Axograph o pCLAMP se puede utilizar para controlar el protocolo de estimulación, para grabar la señal, y para su posterior análisis de las respuestas. Un osciloscopio conectado después de que el amplificador puede ser conveniente para monitoreo en tiempo real del potencial eléctrico al colocar el electrodo de registro y durante las grabaciones EOG. La entrega de los estímulos de olor es controlado por un Picospritzer, que se conecta al mismo equipo utilizado para la adquisición de la señal. La presión de aire en el Picospritzer se establece en 10 psi. Un tanque de aire y el regulador solo se puede utilizar para suministrar aire a la tabla de aire y la Picospritzer. Un segundo tanque de aire y el regulador se utiliza para proporcionar aire para el flujo de aire húmedo, ya que esto requiere una presión más baja y una gran cantidad de flujo de aire. Justo antes de la entrega de un estímulo de olor, la salida Picospritzer está conectado a una botella de olor. La botella de olor se conecta al tubo de suministro de aire. Parte 2: Preparación de electrodos El electrodo de registro es un alambre de plata cloruradas en un vaso capilar sacó llena con solución de Ringer modificadas (135 mM NaCl, 5 KCl, 1 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,4, esterilizada por filtración). El electrodo de referencia es un hilo de plata cloruradas. <ol><li> Instalar alambre de plata en el soporte de los electrodos. Para el electrodo de registro, uno a dos centímetros de alambre que sobresalen del extremo del soporte de los electrodos. Más de alambre se puede dejar para el electrodo de referencia. </li><li> Para añadir la capa de AgCl que el alambre de plata, la posición del cable en 0,1 M NaCl y conectar el soporte del electrodo al polo positivo de una fuente de 1.5 a 9 V de corriente continua. El polo negativo de la fuente de alimentación debe estar conectado eléctricamente a la solución 0,1 M de NaCl. Permitir que la reacción chloriding proceder durante 10 minutos. Para igualar la energía estática entre la grabación y el electrodo de referencia, brevemente los electrodos juntos antes de instalarlas en el aparato de grabación. </li><li> Tirar un vaso capilar mediante un extractor de micropipeta. La abertura en la punta del capilar debe ser alrededor de 5-10 micrones de diámetro. </li><li> Use un lápiz de diamante para marcar y romper el extremo romo de los capilares por lo que es de ~ 2 cm más largo que el alambre de plata. Fuego pulir el corte final con la antorcha de butano. </li><li> Derretir el 0,5% de agarosa en una solución de Ringer modificada. Tirar de una pequeña cantidad de solución de agarosa fundida en la punta del electrodo con una pipeta de transferencia. </li><li> Llenar el capilar retiró aproximadamente 1 / 2 de la forma con la solución de Ringer modificada (una jeringa que se ha calentado y sacó a tener un final largo y fino es útil para este propósito). Agitar suavemente el tubo capilar para eliminar burbujas de aire. Guarde el electrodo lleno en el frasco de almacenamiento con una pequeña cantidad de solución de Ringer modificada en la parte inferior hasta que están listos para ser utilizados. Una vez que una muestra de tejido está preparado y listo para grabar, instalar un capilar lleno sobre el alambre electrodo de registro. </li></ol> Parte 3: Preparación de las soluciones de olor El acetato de amilo olores y evocar respuestas heptaldehyde grande y por lo tanto son opciones buenas como estimulantes EOG. <ol><li> En tubos de microcentrífuga, preparar una serie de diluciones de olor en dimetilsulfóxido (DMSO). Como punto de partida para una curva dosis-respuesta, preparar diluciones de 10 veces a partir de 5 M a 5 x 10 -6 M. Hacer diluciones frescas cada día. </li><li> Volver a diluir los olores de 50 veces en el agua mediante la mezcla de 100 acciones diluidas l en DMSO con 4,9 ml de agua en 2 botellas con tapones de silicona oz. Deje que las soluciones se equilibran en las botellas, por lo menos 30 minutos. Tenga en cuenta que la concentración de vapor de sustancias odoríferas en cada botella se desconoce, pero puede variar en función de la concentración de olores en la fase líquida. </li><li> Insertar dos agujas de calibre 18 a través del tapón de silicona para proveer puertos de entrada y de salida. Los puertos deben estar conectados cuando la botella no está en uso. </li></ol> Parte 4: Registro de los datos y el análisis de EOG <ol><li> Sacrificio de un ratón de CO 2 la eutanasia o la sobredosis de anestesia seguido por decapitación. Quitar la piel que recubre el cráneo y sagital dividir en dos la cabeza a lo largo de la línea media. </li><li> Monte de la mitad de la cabeza, cara medial hacia arriba, sobre el plato de montaje. Retire con cuidado el tabique para exponer los cornetes. </li><li> Coloque el plato con el tejido montado en la etapa de grabación. Alinear el escenario para que el lugar de grabación en los cornetes se centra en el microscopio. </li><li> A su vez en el tanque de aire para proporcionar aire húmedo a la superficie de los cornetes. Coloque el tubo de aire de modo que es de aproximadamente 10 mm de distancia del lugar de grabación. El caudal es de unos 600 ml / min. </li><li> Ajuste el amplificador a modo DC (amplificación AC induce artefactos en la señal EOG) con filtro de paso bajo a 1 kHz, y el aumento en 100 veces. </li><li> Monte de grabación y de referencia en el micromanipulador. </li><li> Baje el electrodo de referencia en el pozo en el plato de montaje y cubrir con una solución de tal manera que está conectado eléctricamente con el tejido modificado Ringer. </li><li> Baje con cuidado el electrodo de registro sobre la superficie del cornete IIb o III. El electrodo debe tocar la superficie del epitelio olfativo! Cuando el electrodo está en contacto con el epitelio (es decir, se completa un circuito eléctrico) una línea de base recta aparecerá en el osciloscopio. </li><li> Coloque una botella de olor para el lado de babor en el tubo de suministro de aire. </li><li> En el equipo, iniciar un protocolo de estimulación. La tasa de muestreo para la adquisición de datos debe ser de 2 kHz o mayor. El software dará lugar a un pulso de olor y comenzar a grabar. </li><li> Un protocolo de estimulación típico puede ser un pulso de 100 mseg de duración única, a la par de 100 mseg pulsos separados por un intervalo de 1 segundo, o 10 segundos de pulso sostenido. </li><li> Espere un tiempo entre los protocolos de manera que el tejido es muy poco adaptadas. Un minuto es suficiente para las concentraciones de líquido de acetato de amilo y heptaldehyde hasta 10 -3 M, en concentraciones más altas permiten 5 minutos. Después de la entrega de altas concentraciones de olor (como al final de una curva dosis-respuesta) olor residual puede permanecer en el tubo. Lave el tubo de aire con un 95% de etanol y seco antes de continuar con las muestras de tejido. </li><li> Axograph software ofrece herramientas para la medición de los parámetros clave de la señal EOG. Estos parámetros incluyen la amplitud de la respuesta, la latencia, el tiempo de pico, y constantes de tiempo de terminación. Puede ser conveniente para filtrar digitalmente las huellas a 25 Hz antes de su posterior análisis. </li></ol> Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig1.jpg" alt="la figura 1" /> Figura 1. Los parámetros para el análisis de EOG. Varios parámetros de la EOG son particularmente útiles para la comparación de las respuestas entre los ratones, incluyendo la amplitud de respuesta, la latencia (el tiempo entre el momento en que el estímulo se administra y se inicia la respuesta), el aumento del tiempo (el tiempo entre el comienzo de la respuesta y el pico), tiempo hasta el pico (el tiempo desde el inicio de la estimulación a la cima de la respuesta), y la constante de tiempo de terminación (τ, determinado mediante el ajuste de la fase de caída de la respuesta a una ecuación exponencial simple ). Para la comparación de los parámetros cinéticos como la latencia, el tiempo de subida, y la constante de tiempo de terminación, es aconsejable para normalizar la amplitud máxima de las respuestas antes del análisis. <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig2.jpg" alt="la figura 2" /> Figura 2. Representante de las señales de EOG en protocolos de estimulación diferente. (A) Ejemplos de EOGs de un ratón en respuesta a la estimulación con concentraciones crecientes de acetato de amilo. La línea de negro en la parte superior del panel indica el tiempo y la duración de la estimulación olor. Las concentraciones en la leyenda son las concentraciones de la solución líquida. (B) una relación dosis-respuesta promedio de cinco ratones. Las barras de error son del 95% intervalos de confianza. La disminución de la amplitud de pico se observa a menudo en concentraciones olor muy alto. (C) Un ejemplo de EOG en respuesta a una estimulación pareada de pulso. Un solo pulso corto de olor provoca la adaptación que dura varios segundos. (D) Un ejemplo de EOG en respuesta a una de 10 segundos de estimulación sostenida de olor. El EOG muestra desensibilización durante la presentación de olor continuo.

<ol>
	<li>Ottoson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+electrical+activity+of+the+olfactory+epithelium.">Analysis of the electrical activity of the olfactory epithelium.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 35, 1-83 (1956).</li><li>Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electroolfactogram:+a+review+of+its+history+and+uses.">The electroolfactogram: a review of its history and uses.</a> Microsc Res Tech. 58, 152-160 (2002).</li><li>Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anosmia+caused+by+a+targeted+disruption+of+the+mouse+olfactory+cyclic+nucleotide-gated+cation+channel.">General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel.</a> Neuron. 17, 681-693 (1996).</li><li>Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+deficient+in+G(olf)+are+anosmic.">Mice deficient in G(olf) are anosmic.</a> Neuron. 20, 69-81 (1998).</li><li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+mammalian+odorant+receptor.">Functional expression of a mammalian odorant receptor.</a> Science. 279, 237-242 (1998).</li><li>Wong, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+type+III+adenylyl+cyclase+gene+leads+to+peripheral+and+behavioral+anosmia+in+transgenic+mice.">Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice.</a> Neuron. 27, 487-497 (2000).</li><li>Munger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+of+the+CNGA4+channel+subunit+in+Ca2+-calmodulin-dependent+odor+adaptation.">Central role of the CNGA4 channel subunit in Ca2+-calmodulin-dependent odor adaptation.</a> Science. 294, 2172-2175 (2001).</li><li>Michalakis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CNGB1+protein+leads+to+olfactory+dysfunction+and+subciliary+cyclic+nucleotide-gated+channel+trapping.">Loss of CNGB1 protein leads to olfactory dysfunction and subciliary cyclic nucleotide-gated channel trapping.</a> J Biol Chem. 281, 35156-35166 (2006).</li><li>Buiakova, O. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+marker+protein+(OMP)+gene+deletion+causes+altered+physiological+activity+of+olfactory+sensory+neurons.">Olfactory marker protein (OMP) gene deletion causes altered physiological activity of olfactory sensory neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9858-9863 (1996).</li><li>Nickell, W. T., Kleene, N. K., Gesteland, R. C., Kleene, S. 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D., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphodiesterase+1C+is+dispensable+for+rapid+response+termination+of+olfactory+sensory+neurons.">Phosphodiesterase 1C is dispensable for rapid response termination of olfactory sensory neurons.</a> Nat Neurosci. 12, 454-462 (2009).</li><li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia.">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem Senses. 33, 839-859 (2008).</li><li>Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+adenylyl+cyclase+inhibits+olfactory+generator+currents+induced+by+"IP(3)-odors".">Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by "IP(3)-odors".</a> J Neurophysiol. 84, 575-5780 (2000).</li><li>Pinato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroolfactogram+responses+from+organotypic+cultures+of+the+olfactory+epithelium+from+postnatal+mice.">Electroolfactogram responses from organotypic cultures of the olfactory epithelium from postnatal mice.</a> Chem Senses. 33, 397-404 (2008).</li><li>Ezeh, P. I., Davis, L. M., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+distribution+of+rat+electroolfactogram.">Regional distribution of rat electroolfactogram.</a> J Neurophysiol. 73, 2207-2220 (1995).</li><li>Scott-Johnson, P. E., Blakley, D., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+air+flow+on+rat+electroolfactogram.">Effects of air flow on rat electroolfactogram.</a> Chem Senses. 25, 761-768 (2000).</li></ol>

Los ratones fueron manipulados y sacrificados con métodos aprobados por el Cuidado de Animales y los Comités de Uso de la Universidad Johns Hopkins.

Con la configuración descrita en este protocolo, los estímulos de olor en la superficie del epitelio olfativo serán compatibles entre preparaciones de tejidos, que permite la comparación entre el tipo salvaje y ratones mutantes, a pesar de que la concentración de olor y la dinámica exacta se desconoce. Varios factores, especialmente la ubicación de la grabación y la velocidad de flujo de aire húmedo, causan variaciones en la EOG. Se debe tener cuidado para grabar desde posiciones similares en el mismo para minimizar la variación de los cornetes. Esto se puede conseguir fácilmente de forma constante la grabación desde el mismo lado de la cabeza y mantener la huella del microscopio, tubo de olor, y micromanipuladores en la mesa de aire sin cambios entre las muestras de tejido. Además, muestras de tejidos deben ser puestos inmediatamente en el flujo de aire húmedo después de la disección para evitar la desecación excesiva de los tejidos. Grabaciones de EOG en ratones también pueden llevarse a cabo con un aparato de perfusión de líquido al pasar el ratón preparado cornetes 7, 14, 15, o dejando la cabeza intacta e insertar el electrodo en un pequeño agujero por encima de los 16 cornetes, 17. Cada variación de grabación EOG tiene sus propias fortalezas: la fase de aire grabaciones en preparaciones de tejidos como se describe en este protocolo requiere una cantidad mínima de instalación y son los más fáciles de llevar a cabo, las grabaciones con un aparato de perfusión líquido facilitar el uso de reactivos farmacológicos, aunque la naturaleza hidrofóbica de sustancias odoríferas muchos complica la entrega de olor, por último, las grabaciones en las que se deja intacta la cabeza se pueden utilizar en &quot;artificial olfatear&quot; los experimentos, a pesar de la colocación del electrodo es más difícil que cuando los cornetes están totalmente expuestos.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Air delivery tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Custom fabricated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute</td>
</tr>
<tr>
<td>Air table</td>
<td>equipment</td>
<td>Newport</td>
<td>LW3030B-OPT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amplifier</td>
<td>equipment</td>
<td>Warner</td>
<td>DP-301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Computer and Data Acquisition Software</td>
<td>equipment</td>
<td>Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/.</td>
</tr>
<tr>
<td>Butane torch</td>
<td>equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A cr&egrave;me br&ucirc;l&egrave;e torch works well</td>
</tr>
<tr>
<td>Digitizer</td>
<td>equipment</td>
<td>Axon Instruments</td>
<td>Digidata 1322A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Scope</td>
<td>equipment</td>
<td>Scienscope</td>
<td>SSZ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrode holder</td>
<td>equipment</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>64-1021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic Holding Devices (12 mm)</td>
<td>equipment</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>M10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulators</td>
<td>equipment</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>M3301R M3301L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>equipment</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oscilloscope</td>
<td>equipment</td>
<td>Tektronix </td>
<td>5110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer III</td>
<td>equipment</td>
<td>Parker Instrumentation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone tubing</td>
<td>equipment</td>
<td>Nalge Nunc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Specimen stage</td>
<td>equipment</td>
<td>Custom fabricated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay.</td>
</tr>
<tr>
<td>18 gage needles</td>
<td>material</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>305195</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 oz. glass bottles</td>
<td>material</td>
<td>VWR International</td>
<td>16152-201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass capillaries</td>
<td>material</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW150F-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone stoppers size 16D</td>
<td>material</td>
<td>Chemware</td>
<td>D1069809</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silver wire</td>
<td>material</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>AGW1010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SylGuard 184</td>
<td>material</td>
<td>Dow Corning </td>
<td>SYLG184</td>
<td>From World Precision Instruments</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amyl acetate</td>
<td>reagent</td>
<td>Aldrich</td>
<td>W504009</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C-1016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5879</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heptaldehyde</td>
<td>reagent</td>
<td>Aldrich</td>
<td>H2120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2+6H2O)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M9272</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
<td>reagent</td>
<td>JT Baker</td>
<td>3624-05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>flowmeter</td>
<td>equipment</td>
<td>Gilmont</td>
<td>GF-2260</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording

Los animales dependen del olfato para muchos comportamientos críticos, como la búsqueda de fuentes de alimento, evitar a los depredadores, y la identificación de su misma especie para aparearse y otras interacciones sociales. El electroolfactogram (EOG) de grabación es un método informativo, fácil de realizar, y confiable de la función olfatoria de ensayo a nivel del epitelio olfativo. Desde la descripción de 1956 de la EOG por Ottoson en las ranas 1, el registro EOG se ha aplicado en muchos vertebrados como las salamandras, conejos, ratas, ratones y seres humanos (revisado por Scott y Scott-Johnson, 2002, ref. 2). Los recientes avances en la modificación genética en ratones han reavivado el interés en la grabación de la EOG para la caracterización fisiológica de la función olfatoria en el knock-out y knock-en ratones. EOG grabaciones se han aplicado con éxito para demostrar el papel central de los componentes de transducción de señales olfativas 3-8, y más recientemente para caracterizar la contribución de ciertos mecanismos de regulación de las respuestas OSN 09.12. Detección de olor se produce en la superficie del epitelio olfatorio en los cilios de la OSN, donde una cascada de transducción de señales conduce a la apertura de los canales iónicos, lo que genera una corriente que fluye hacia los cilios y despolarización de la membrana 13. La EOG es el potencial negativo registrado extracelularmente en la superficie del epitelio olfativo a la estimulación de olor, como resultado de la suma de los posibles cambios causados ​​por cada OSN de respuesta en el campo de la grabación 2. La comparación de la amplitud y la cinética de la EOG así información valiosa sobre la modificación genética y otras manipulaciones experimentales influyen en la señalización moleculares que subyacen a la respuesta a la OSN olor. A continuación se describe una grabación EOG aire en una fase de preparación de los cornetes ratón olfativo. En pocas palabras, tras sacrificar a los ratones, los cornetes olfativas son expuestos por la cabeza que divide a lo largo de la línea media y la eliminación del tabique. La preparación de los cornetes se coloca en la configuración de la grabación, y un electrodo de registro se coloca en la superficie del epitelio olfatorio en uno de los cornetes medial. Un electrodo de referencia está conectado eléctricamente con el tejido a través de una solución tampón. Un flujo continuo de aire húmedo se sopla sobre la superficie del epitelio para mantenerlo húmedo. El vapor de las soluciones de olor se dispersa en el flujo de aire húmedo para estimular el epitelio. Las respuestas son grabadas y digitalizadas para su posterior análisis.

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Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

El electroolfactogram (EOG) de grabación es una manera informativa, fácil de realizar, y fiable para evaluar la función olfatoria a nivel del epitelio olfativo. Este protocolo describe un sistema de grabación, preparación de los tejidos del ratón, la recopilación de datos y análisis de datos básicos.

Las respuestas de los análisis de las neuronas sensoriales olfativas ratón Utilizando la grabación Electroolfactogram Aire fase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

analyzing-responses-mouse-olfactory-sensory-neurons-using-air-phase

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.4K vistas.  Johns Hopkins University. El electroolfactogram (EOG) de grabación es una manera informativa, fácil de realizar, y fiable para evaluar la función olfatoria a nivel del epitelio olfativo. Este protocolo describe un sistema de grabación, preparación de los tejidos del ratón, la recopilación de datos y análisis de datos básicos.

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Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus mediada por la manipulación genética y la visualización de las neuronas sensoriales olfativas In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Investigación

Neurociencias

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Flash fotólisis de compuestos enjaulados en los cilios de las neuronas sensoriales olfativas

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

Inducidas Odorante-respuestas registradas de neuronas olfativas del receptor utilizando la técnica de aspiración con una pipeta

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

Intracelular de grabación, Sensorial Asignación de campos, y el cultivo de neuronas identificadas en el Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Todo el montaje de Immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Grabación Luz evocó-Respuestas postsinápticos en las neuronas en adaptadas oscuro, Preparaciones ratón retina Slice Uso de técnicas Patch Clamp

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house single or multiple neurons inside, are considered to make the major contribution in responding to the chemical stimuli. By directly recording action potential in the olfactory sensillum after exposure to stimuli, single sensillum recording (SSR) technique provides a powerful approach for investigating the neural responses of insects to chemical stimuli. For the bed bug, which is a notorious human parasite, multiple types of olfactory sensillum have been characterized. In this study, we demonstrated neural responses of bed bug olfactory sensilla to two chemical stimuli and the dose-dependent responses to one of them using the SSR method. This approach enables researchers to conduct early screening for individual chemical stimuli on the bed bug olfactory sensilla, which would provide valuable information for the development of new bed bug attractants or repellents and benefits the bed bug control efforts.

Bed bugs rely on olfactory receptor neurons housed in their antennal olfactory sensilla to detect semiochemicals in the environment. Utilizing single sensillum recording, we demonstrate a method to evaluate bed bug response to semiochemicals and explore the coding process involved.

Uso Individual sensillum grabación para detectar respuestas olfativo neurona de chinches de cama a Semioquímicos

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Comportamientos olfativas ensayó mediante seguimiento informático de<em&gt; Drosophila</em&gt; En un olfatómetro de cuatro cuadrantes

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Imunocoloración Cuádruple del Bulbo Olfativo para la Visualización de Códigos de Identidad Molecular del Axón Sensorial Olfativo

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...