Este es el método más robusto y sensible para evaluar la sensibilidad olfativa en peces marinos, ya que registra una señal puramente sensorial antes de cualquier procesamiento por parte del SNC. Las principales ventajas de esta técnica son su sensibilidad y que se puede transferir fácilmente a una especie diferente desde un entorno diferente independientemente de la salinidad externa. Para preparar el agua de control, recoja un litro de agua de mar filtrada con carbón y utilice una sonda de pH para comprobar el pH.
El pH debe ser alrededor de 8.2. Si no es así, burbujea el agua de mar con aire atmosférico hasta alcanzar un pH de 8.2. A continuación, utilice un valorador de alcalinidad para medir la alcalinidad del agua, luego mida la temperatura del agua y la salinidad.
Para preparar agua de alto dióxido de carbono, filtre un litro de agua de mar a través de filtros de carbón inactivado con partículas antes de burbujear con dióxido de carbono hasta alcanzar el pH deseado. Utilice una sonda de pH para comprobar el pH, que debe ser alrededor de 7.7, luego utilice un valorador de alcalinidad para medir la alcalinidad del agua y medir la temperatura y la salinidad del agua. Para determinar la presión de dióxido de carbono tanto en el control como en el agua de alto dióxido de carbono, abra un programa de software diseñado para calcular los parámetros de dióxido de carbono en el agua y añadir los valores de salinidad, temperatura, presión, alcalinidad total y pH del agua a la ventana de entrada.
A continuación, seleccione las constantes, las escalas y las unidades, y haga clic en el proceso para determinar la presión de dióxido de carbono. Después de confirmar un nivel adecuado de sedación por falta de respuesta al pellizco de cola, coloque el pez anestesiado en un soporte de cojín personalizado para el modelo y coloque un tubo de silicio del tamaño adecuado en la boca del pez. El tubo está conectado a una bomba sumergible y un reservorio de anestésico que contiene agua de mar aireada y agua se bombea sobre las branquias en un aproximadamente 100 mililitros por minuto por kilogramo de velocidad.
A continuación, inserte un pasador de puesta a tierra en el músculo del flanco y conecte el pasador a la etapa de la cabeza del amplificador. Cubra el pescado con un paño húmedo con sólo la cabeza expuesta y coloque el tubo con el sistema de entrega de estímulo dentro de la fosa nasal. Para exponer los nervios olfativos, utilice un taladro y un microscopio diseccionado para eliminar la piel y el hueso del cráneo entre los ojos.
Cuando utilice un besugo, utilice una sierra circular para eliminar la parte del cráneo inmediatamente por encima de los ojos para sólo posterior a los ojos y utilice el taladro para eliminar el hueso entre los ojos. Una vez que se haya limpiado suficiente hueso, utilice fórceps finos para eliminar la grasa y el tejido conectivo que sobrepasan los nervios olfativos sin dañar los nervios o los vasos. Limpie los electrodos antes de usarlos conectándolos al polo negativo de una fuente de CC de tres voltios y colocando la punta en solución salina fisiológica durante 20 a 30 segundos.
Se debe ver un flujo constante de pequeñas burbujas provenientes de la punta. Conecte los electrodos de tungsteno recubiertos de parileno a la etapa principal de un preamplificador de CA de corriente alterna. Una vez expuestos los nervios olfativos, utilice micromanteladores para insertar los electrodos en el nervio olfativo adecuado en una posición que dé una respuesta máxima al estándar y una respuesta mínima al espacio en blanco.
Siempre que la disección haya ido sin problemas, el paso crítico es poner los electrodos en la posición correcta. Esto puede llevar tiempo e implica un cierto grado de prueba y error. Para obtener lecturas electrofisiológicas, utilice una válvula de tres vías operada por solenoide para configurar un sistema de administración de estímulos para permitir el cambio rápido de agua de fondo limpia a estímulo que contenga agua y conecte la salida común al tubo que transporta agua a la roseta olfativa.
Coloque una línea en agua de mar de fondo y la otra en la solución de prueba. Conecte el controlador de válvula al gatillo de un convertidor digital analógico y configure el software para iniciar la grabación en el evento de disparo y continuar durante un período predeterminado. Para comprobar la estabilidad de la preparación, registre y mida repetidamente la amplitud de la respuesta integrada repetidamente con la norma permitiendo que transcurra un minuto entre los estímulos sucesivos.
A continuación, registre las respuestas del nervio olfativo a los aminoácidos en el agua de mar de control, y permita que transcurra un minuto entre los estímulos sucesivos, luego registre la respuesta a una por 10 a la tercera serina molar negativa en una solución de control en blanco del agua. A continuación, registre las respuestas del nervio olfativo a los aminoácidos en el agua de mar de dióxido de carbono alto. La respuesta a una solución en blanco de agua de dióxido de carbono alta y la respuesta a una vez 10 al tercer serina molar negativa en una solución de control en blanco de agua.
Aquí, se muestran las respuestas típicas a los estímulos de control positivos y negativos registrados a partir del nervio olfativo de un besugo marino. Dentro de aproximadamente un segundo de la aplicación del estímulo, se puede observar un rápido aumento de la actividad seguido de un período de adaptación mientras el estímulo todavía está presente y un retorno a la actividad basal una vez que el estímulo ha terminado. Por el contrario, un estímulo en blanco evoca poca o ninguna respuesta.
En esta curva de respuesta de concentración típica, se puede observar que el aumento de las concentraciones de un olor puede evocar aumentos cada vez mayores en la actividad y, por lo tanto, la amplitud de las respuestas integradas. La trazado de los datos normalizados y la regresión lineal correspondiente permite la estimación del umbral de detección para las respuestas de concentración de cada animal o grupo de animales. Las curvas de respuesta de concentración sigmoidal se pueden trazar semi-logarítmicamente, permitiendo el cálculo de la concentración de olores que evoca una respuesta máxima del 50%.
Es importante mantener el pescado lo más saludable posible. Por ejemplo, asegúrese de que las branquias estén adecuadamente irrigadas y de que el epitelio olfativo se mantenga húmedo durante la grabación. Uno de nuestros objetivos es rastrear las vías neuronales en el cerebro hasta donde se transmite la información sensorial.
