Este trabajo fue apoyado por la &quot;Agence Nationale de la Recherche&quot; subvención ANR-09-JCJC-0117-01 y &quot;Neuropôle de Investigación Francilien-NERF&quot; subvención para Romain Chery. Damos las gracias a Françoise Lefebvre para el desarrollo de software en C + + / Qt, y Laurent Pinot y Janvier Batiste para ayudar en el desarrollo de la configuración de imagen óptica.

1. Preparación de los animales para obtener imágenes (de acuerdo con las recomendaciones europeas para el cuidado y uso de animales de laboratorio, la Directiva 86/609/CEE) <ol><li> 6 a 8 semanas de edad C57BL6 ratones machos son anestesiados con una mezcla de ketamina (10mg/kg) y xilazina (100mg/kg) inyectó intraperitonealmente. La cirugía comienza cuando el ratón no responde a pata trasera pellizco. Durante todo el experimento el animal es colocado en una almohadilla térmica. La temperatura corporal es de un seguimiento continuo y se mantiene a 37 ° C. Profundidad de la anestesia se mantiene durante toda la cirugía y la sesión de imágenes por el control de la ausencia de las extremidades retirarse. Una inyección subcutánea de 20% de la inicial cóctel anestésico administrado de otra manera. </li><li> Usando las podadoras, quitar el pelo del cuero cabelludo. Limpie la piel desnuda de pelo residual mediante el uso de una gasa estéril empapada con una solución salina. </li><li> Sitúa el cursor en el marco estereotáxico. El hocico tiene que estar en el mismo plano que la parte de atrás de la cabeza,a fin de establecer la superficie del bulbo olfatorio a la horizontal. Asegure firmemente la oreja y la nariz con el fin de bares para evitar movimientos durante la exploración. </li><li> Aplique una pomada oftálmica en los ojos del animal para evitar la sequedad y el dolor. </li><li> Desinfectar todos los instrumentos quirúrgicos con etanol 70 ° y el cuero cabelludo con barridos sucesivos de betadine. </li><li> Para eliminar la piel que cubre el cráneo, comienza haciendo una incisión en la piel con unas tijeras en la parte posterior de la cabeza entre las orejas. Luego se corta en dos partes hacia la base de la oreja y en la dirección antero-posterior hacia el frente, a lo largo de los párpados. Terminar de quitar el cuero cabelludo por el corte de la piel en la parte superior del hocico cerca de la barra de la nariz. </li><li> Bajo observación binocular, use un hisopo de algodón empapado con una solución salina para separar suavemente el periostio en la parte superior del cráneo. Use unas pinzas para extraer el tejido restante y raspar la superficie del cráneo con un bisturí para tener una preparación limpia. </li><li>El OB es una estructura simétrica compuesta de dos hemibulbs que se encuentran entre los párpados. Están limitados en la rostral y caudal en la dirección de un seno venoso, y separados por la sutura sagital. Coloque un pedazo de esponja de gelatina absorbible empapado con agua destilada en el hueso por encima del OB. Es importante mantener esta área del hueso húmedo durante todo el experimento. </li></ol> 2. Preparación de la ventana craneal <ol><li> Quite la esponja de gelatina y empezar a raspando suavemente el hueso con el n º 10 hoja de bisturí. Mantener un ángulo constante de 45 ° entre la hoja y el hueso, y mover la hoja de los párpados al lado sagital de los campos de tulipanes. No aplique una presión vertical sobre el hueso o el principio del hueso por encima del seno venoso. </li><li> Durante el proceso de adelgazamiento, parar cada 5 minutos y colocar una esponja de gelatina hidratada en el hueso que se enfríe la preparación. Limpie la cabeza con la esponja para quitar el polvo de hueso. </li><li> Mantener barrido yde refrigeración, alternativamente, hasta que la visualización de las trabéculas, la capa de hueso esponjoso. La vasculatura fina del OB debe ser visible en esta etapa. Dejar de rascarse el hueso, y comenzar a usar la punta del bisturí de forma perpendicular a &quot;dibujar&quot; un área rectangular que encierra el OB. En esta etapa, n ° 11 hoja de bisturí puede ser utilizado. Mantener la operación dentro de los límites de los senos venosos que debe ser seguro de cualquier golpe de bisturí. </li><li> Excavar la zanja de forma gradual rectangular con movimientos sucesivos del bisturí. Limpie la punta del bisturí periódicamente para limpiarlo y mantenerlo fuerte. Tenga mucho cuidado con la profundidad de la punta para evitar el contacto con la superficie dura. </li><li> Con el fin de tener una idea del grosor del hueso restante, presione suavemente con la punta de un par de pinzas. Si los pliegues colgajo óseo bajo presión, pasar a la siguiente etapa. </li><li> Bajo una gota de solución salina, utilice la punta del bisturí orientado horizontalmente para levantar el colgajo óseo. La eliminación de la aleta se tiene que hacer carefully para evitar que se rompa el hueso restante. </li><li> Una vez que la superficie de la OB está expuesta, comprobar la ausencia de sangrado o anastomosis de los vasos sanguíneos. Hiriendo a la duración o la superficie del tejido se reducen las posibilidades de obtención de las señales ópticas. Limpie el área con una esponja de gelatina empapada en una solución salina para mantener la humedad del bulbo. </li><li> Aplique el cemento dental poliacrilato para formar un pozo en el hueso alrededor de la ventana. </li><li> Ponga una gota de bajo punto de fusión de agarosa (1,2%) a lo largo de la dura, y poner una cubierta de vidrio estéril en las dimensiones de la ventana. Durante la sesión de imágenes, una pequeña cantidad de agarosa se puede agregar a fin de compensar la deshidratación. Agarosa evitará que el OB se mueva con la respiración y proporcionar una superficie plana para la obtención de imágenes ópticas. </li></ol> 3. Configuración de imagen óptica para el mapeo de la actividad olfativa <ol><li> La estimulación olfativa debe ser definido con precisión en el tiempo y la intensidad de la utilización de un olfatómetro. Utilizamos una versión modificada de costumbre MultiVial sistema de perfusión 8II Valvebank de Automatización de la Ciencia básica asociada a un compresor de aire (aire comprimido respirable sería adecuado también). Este sistema permite un control preciso de la válvula rápida y externos. Las soluciones de olor puro se diluyen en aceite mineral en la concentración elegida. Para activar los aldehídos dorsal OB como hexanal se utilizan comúnmente. Un volumen preciso de la sustancia olorosa diluida (20 a 50μl) se carga en un papel de filtro y se coloca en un depósito de la jeringa. A través del sistema de perfusión, la presión de aire controlado se entrega al sistema, asegurando una velocidad constante de entrega odorizado flujo de aire en la nariz de los animales durante la apertura de la válvula. Olor se entrega a través de un tubo Tygon R-3603 de vacío (Saint-Gobain Corporation) llevar el aire a un caudal de ~ 1000ml/min. Evitar la contaminación entre los olores y cantidad de residuos de olor en el tubo. Si está disponible, la reproducibilidad de los estímulos de olor puede ser controlled a través del uso de un detector de ionización de llama (2020 microFID Photovac). </li><li> La configuración óptica está encendido. Se trata de un enfriado entrelazado 12 bits cámara CCD (ORCA AG Hamamatsu) asociado con un microscopio estereoscópico de fluorescencia (Leica MZ16), un olfatómetro controlado por ordenador y se estabilizaron las lámparas de excitación con las correspondientes filtros de banda de interferencia. Un esquema que describe nuestra configuración se proporciona en la figura 2. Para intrínseca señales ópticas de imagen (IOSI), una lámpara halógena de tungsteno de 200W (Oriel QTH), junto con un anillo de luz de fibra (Schott) conectado todo el objetivo del microscopio se utilizan para proporcionar una iluminación estable y uniforme. Para flavoproteína autofluorescencia señales de imagen (FASI), una lámpara de metal Halide 150W (Leica) con una guía de luz líquida central 5mm proporcionar incluso la excitación de la fluorescencia localizada a través del puerto de epi-iluminación de la lupa binocular. Adquisición de la imagen y la sincronización de hardware se realiza por software a la medida. La s abiertauente micromanager software también se puede utilizar para controlar la configuración óptica y la adquisición. </li></ol> 4. Imágenes ópticas <ol><li> Coloque el marco estereotáxico bajo el microscopio estereoscópico, la ventana del cráneo centrada en el campo de visión (ver fig. 2A para un esquema de la configuración óptica). </li><li> Ajustar el microscopio para centrarse en los capilares. Antes de los ensayos de estimulación (ver descripción en 5) una imagen de la bombilla se toma en 560nm (verde) luz (anillo de fibra), que proporciona un buen contraste para la imagen de los vasos sanguíneos. Esta imagen se utiliza como control anatómica para comprobar el estado de la preparación y se adquiere en varias ocasiones durante el experimento. </li><li> Para IOS de imagen, refleja la intensidad de la luz es grabada por la cámara CCD con 630 + / -10 nm (rojo) de iluminación. Las imágenes se adquieren en el fotograma completo (sin hurgar en la basura) a 5 fotogramas por segundo que corresponden a un tiempo de exposición de alrededor de 150 ms. El poder de la fuente de luz se ajusta de nuevo<html> ada niveles de grises de por lo menos ~ 3000 en el área de obstetricia, cerca de la saturación de los pozos CCD píxeles. Si lo hace, lo hace posible para aprovechar la dinámica de 12bits de la CCD para capturar los cambios de intensidad débil durante la activación. Máxima IOS amplitudes llegar a aproximadamente el 1%. </li><li> De FAS imágenes de fluorescencia se adquiere bajo la excitación de 480nm + /-20nm (azul) epiflurorescence. Un filtro de paso alto a 515nm está configurado para capturar la luz. Las imágenes se adquieren en 5 fotogramas por segundo con un binning de 4 por 4 para maximizar la sensibilidad. Potencia de excitación de luz se ajusta de manera similar a IOS con niveles de gris de 3000 en el área de obstetricia. Máxima amplitud FAS llegar a 3%. Para ambas modalidades de imagen, la profundidad de campo en el plano sujeto es el mismo y se midió en 0,5 mm para un aumento de alrededor de 4 veces. </li><li> La luz debe estar apagada entre las pruebas de imagen para evitar el calentamiento y photobleaching de la preparación. </li></ol>le &quot;&gt; 5. Imágenes ensayos <ol><li> Sesión de imágenes estándar incluye un punto de referencia de 5 a 10 segundos donde se entrega sólo aire, seguido de la estimulación olor de 3 a 10 segundos dependiendo de la concentración de olor elegido, y de 70 a 82s son más grabado con un flujo de aire constante para la recuperación de línea de base (Fig. 2A). Al final de la prueba, la luz se apaga y el aire puro se entrega a la duración del ensayo intervalo entre (1 a 3 minutos) para lavar las moléculas de olor residual y evitar la habituación sensorial. Ensayos olor se intercalan con las pruebas en blanco (la entrega de aire). </li><li> Evoca el olor zonas activadas se visualizan como zonas más o menos esférico en los mapas y se corresponden con el tamaño de cada uno de los glomérulos (80 a 200μm de diámetro 9). Procesamiento de imágenes se explica en la Figura 2B. Mapas olfativos se presentan en la Figura 3. Al contrario de cualquier sistema sensorial, la relación señal-ruido en el OB fue suficiente para resolver el olor evoca respuestas en las pruebas individuales (Fig. 3B para IOS y la figura. 3D para FAS). </li><li> Los ratones son sacrificados inmediatamente después del final de la sesión de imágenes utilizando métodos de acuerdo con las recomendaciones europeas para el cuidado y uso de animales de laboratorio. </li></ol> 6. Los resultados representativos (ver mapas olfativa en la figura 3): <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig1.jpg" /> Figura 1 Organización estructural del bulbo olfativo principal de los roedores. Las neuronas sensoriales olfativas, células primarias sensoriales localizados en el epitelio olfativo principal, expresan el receptor odorante mismo y convergen en el mismo glomérulo en el OB. Glomérulos olfativos, la neuropils de forma redonda (los círculos de puntos), se encuentran en la superficie del OB. Tenga en cuenta que una red vascular muy densa y compleja está presente a nivel glomerular. Abreviaturas (arriba / abajo): ONL: capa del nervio olfatorio, GL: capa glomerular, EPL: capa externa plexiforme; MCL:capa de células mitrales, GCL: capa de células granulares. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig2.jpg" /> Figura 2 de reflectancia y las señales de fluorescencia de grabación en vivo. A. de campo amplio de configuración de imagen óptica. El cerebro de un ratón anestesiado se expone a cualquiera de rojo (IOS) o azul (FAS) a través de la luz sea un anillo de fibra anular en la lente óptica o un puerto de epi-iluminación de un microscopio. Los olores se cargan en frascos herméticamente cerrados y odorizado aire es entregado a la nariz de los animales (de color verde claro: abrir la válvula). B. Registro del protocolo y el procesamiento de datos. IOS y FAS se registran como una serie de ensayos individuales (90 de duración). El diagrama muestra la línea de tiempo de un solo ensayo: referencia varía de 5 a 10 segundos, la estimulación de 3 a 10 segundos, y vuelven a su nivel de 70 a 82s. Procesamiento de imágenes requiere píxel por píxel sustracción de valores de intensidad durante la línea de base a los valores de intensidad durante períodos de estimulación (por FAS) or estimulación más el retorno a los valores basales (IOS). Esta diferencia se divide entre los valores de referencia para obtener una variación en% (ver imágenes resultantes en la fig. 3). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig3.jpg" /> Figura 3 de olores evocan mapas actividad en el OB con IOS y la imagen FAS. A. Vasos sanguíneos de la dorsal OB visualizados con luz verde. BC. IOS imagen (solo ensayo en comparación con un promedio de tres ensayos, respectivamente) para una presentación de 10 segundos de un 20% hexanal. Las flechas blancas indican las regiones esféricas de interés activa por este olor. Estos mapas de activación se han obtenido utilizando los marcos de promedio durante el primer segundo después de la final de la estimulación olor (con un máximo de variación de reflectancia -0,63% en A y B en -0,52%). Tenga en cuenta las zonas de negro de absorbancia en la activación de olor se ha producido. CD. FAS adquirido de forma secuencial en el mismo ratón de la misma sustancia odorífera (único ensayo frente a un promedio de tres ensayos respectivosly). Estos mapas de activación se han obtenido utilizando los marcos de promedio durante el primer segundo después del comienzo de la estimulación olor (con un máximo de variación de fluorescencia 0,72% en el D y 0,66% en E). Tenga en cuenta que las zonas blancas de la emisión de autofluorescencia indicado por flechas de color negro corresponden a las zonas de negro en IOS. El aspecto granulado se ve en el mapa FAS se debe a la 4 por 4 de agrupación para el mejoramiento de la sensibilidad. FAS imágenes no fueron corregidos a partir de la autofluorescencia de blanqueo. Las dimensiones reales de las imágenes SER: 0,7 mm de ancho x 1,2 mm de largo.

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	<li>Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals.">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li><li>Rubin, B. D., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+odorant+representations+in+the+mammalian+olfactory+bulb.">Optical imaging of odorant representations in the mammalian olfactory bulb.</a> Neuron. 23, 499-511 (1999).</li><li>Chance, B., Cohen, P., J&amp;246, b. s. i. s., &amp;amp, F., Schoener, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+oxidation-reduction+states+in+vivo.">Intracellular oxidation-reduction states in vivo.</a> Science. 137, 499-508 (1962).</li><li>Shibuki, K., Hishida, R., Murakami, H., Kudoh, M., Kawaguchi, T., Watanabe, M., Watanabe, S., Kouuchi, T., Tanaka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+somatosensory+cortical+activity+in+the+rat+visualized+by+flavoprotein+autofluorescence.">Dynamic imaging of somatosensory cortical activity in the rat visualized by flavoprotein autofluorescence.</a> J. Physiol. 549 (Pt. 3, 919-9127 (2003).</li><li>Uchida, N., Takahashi, Y. K., Tanifuji, M., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odor+maps+in+the+mammalian+olfactory+bulb:+domain+organization+and+odorant+structural+features.">Odor maps in the mammalian olfactory bulb: domain organization and odorant structural features.</a> Nat. Neurosci. 3, 1035-1043 (2000).</li><li>Gurden, H., Uchida, N., Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory-evoked+intrinsic+optical+signals+in+the+olfactory+bulb+are+coupled+to+glutamate+release+and+uptake.">Sensory-evoked intrinsic optical signals in the olfactory bulb are coupled to glutamate release and uptake.</a> Neuron. 52, 335-345 (2006).</li><li>Soucy, E. R., Albeanu, D. F., Fantana, A. L., Murthy, V. N., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+diversity+in+an+odor+map+on+the+olfactory+bulb.">Precision and diversity in an odor map on the olfactory bulb.</a> Nat. Neurosci. 12, 210-220 (2009).</li><li>Frostig, R. D., Lieke, E. E., Ts'o, D. Y., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+functional+architecture+and+local+coupling+between+neuronal+activity+and+the+microcirculation+revealed+by+in+vivo+high-resolution+optical+imaging+of+intrinsic+signals.">Cortical functional architecture and local coupling between neuronal activity and the microcirculation revealed by in vivo high-resolution optical imaging of intrinsic signals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 6082-6086 (1990).</li><li>Meister, M., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+and+topography+in+an+odor+map+on+the+rat+olfactory+bulb.">Tuning and topography in an odor map on the rat olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 21, 1351-1360 (2001).</li><li>Dunn, A. K., Devor, A., Bolay, H., Andermann, M. L., Moskowitz, M. A., Dale, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+total+cerebral+hemoglobin+concentration,+oxygenation,+and+blood+flow+during+functional+activation.">Simultaneous imaging of total cerebral hemoglobin concentration, oxygenation, and blood flow during functional activation.</a> Opt. Lett. 28, 28-30 (2003).</li><li>L'Heureux, B., Gurden, H., Pain, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+imaging+of+NADH+and+flavoproteins+in+the+rat+brain:+insights+from+Monte+Carlo+simulations.">Autofluorescence imaging of NADH and flavoproteins in the rat brain: insights from Monte Carlo simulations.</a> Optics. Express. 17, 9477-9490 (2009).</li><li>Renaud, R., Gurden, H., Chery, R., Bendhamane, M., Martin, C., Pain, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+the+olfactory+bulb+activation:+influence+of+realistic+differential+pathlength+correction+factors+on+the+derivation+of+oxygenation+and+total+hemoglobin+concentration+maps+(Proceedings+Paper).">Multispectral imaging of the olfactory bulb activation: influence of realistic differential pathlength correction factors on the derivation of oxygenation and total hemoglobin concentration maps (Proceedings Paper).</a> , (2011).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

En este artículo presentamos IOS y FAS técnicas de imagen para grabaciones en vivo de olor evoca las actividades en el OB de ratón. Para lograr este objetivo relativamente simple y asequible de gran campo de configuración de imagen óptica es necesario. La adquisición de datos de imágenes requiere de un entrenamiento para llevar a cabo los procedimientos quirúrgicos muy bien y evitar cualquier daño a la duración o el tejido cerebral. En particular, la hemorragia mayor se registró para absorber los fotones de imagen y terminar el experimento. Uno de los beneficios de IOS y la imagen FAS es para evitar la inyección de trazadores fluorescentes que podrían dar lugar a toxicidad celular o efectos secundarios no deseados. Ellos hacen posible que para abordar temas acerca de los mapas por lo tanto olfativo de codificación espacial de los estímulos sensoriales. Al contrario de 2-desoxiglucosa imágenes, que ofrecen la posibilidad de olores de varias imágenes en un solo animal. Sin embargo, dado que la penetración de fotones está limitada en el tejido, el IOS y el FAS se limitan a la parte dorsal de la OBy no se puede grabar a partir de las regiones ventral. Imágenes de endógena de la señal óptica ofrece una excelente resolución espacial de imágenes in vivo. Cálculos técnicos servir para mejorar cuantitativa de los componentes vasculares en la reflexión de las señales de 8,9 así como la dinámica de la oxigenación sanguínea y el volumen durante la activación sensorial 10. Imágenes múltiples longitudes de onda de la imagen IOS enfoques se desarrollan actualmente en nuestro laboratorio para cuantificar totalmente la concentración de hemoglobina total y de oxigenación en el OB durante la activación sensorial. Estas mediciones espectroscópicas ópticas añadido a FAS imagen dará la oportunidad de responder a la relación sin resolver entre la dinámica vascular e intracelulares durante la activación sensorial 11,12.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de El Regente </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Imalgene </td><td> Merial </td><td></td></tr><tr><td> Rompun </td><td> Bayer </td><td></td></tr><tr><td> Agarosa, tipo III-A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9793-50G </td></tr><tr><td> Hexanal 98% </td><td> Aldrich </td><td> 115606-100ML </td></tr></tbody></table>

imaging odor-evoked activities in the mouse olfactory bulb using optical reflectance and autofluorescence signals

En el cerebro, la estimulación sensorial activa las poblaciones de neuronas distribuidas entre módulos funcionales que participan en la codificación de los estímulos. Técnicas de imagen funcional óptica tienen la ventaja de visualizar la activación de estos módulos en cortezas sensoriales con alta resolución espacial. En este contexto, endógeno señales ópticas que surgen de los mecanismos moleculares ligados a neuroenergetics son fuentes valiosas de cambio para registrar mapas espaciales de los estímulos sensoriales sobre los campos de ancho en el cerebro de roedores. Aquí, se presentan dos técnicas basadas en los cambios endógenos de las propiedades ópticas del tejido cerebral durante la activación. En primer lugar las señales ópticas intrínsecas (IOS) se producen por una alteración local en la reflexión de la luz roja debido a: (i) la absorción por los cambios en el nivel de oxigenación de la sangre y el volumen sanguíneo (ii) la dispersión de fotones. El uso de IOS en vivo para grabar mapas espaciales comenzó a mediados de 1980 con el observatien los mapas ópticos de barriles bigotes de la rata y las columnas de orientación en la corteza visual del gato 1. Imágenes de IOS de la superficie de los roedores principales bulbo olfatorio (OB), en respuesta a los olores se demostró más tarde por el grupo de Larry Katz 2. El segundo enfoque se basa en las señales de autofluorescencia flavoproteína (FAS), debido a los cambios en el estado redox de estos productos intermedios del metabolismo mitocondrial. Más precisamente, la técnica se basa en la fluorescencia de color verde debido al estado de oxidación de las flavoproteínas cuando el tejido está muy entusiasmado con la luz azul. A pesar de estas señales fueron probablemente una de las primeras moléculas fluorescentes registrados para el estudio de la actividad cerebral de los estudios pioneros de Oportunidades Britton y sus colegas 3, no fue sino hasta recientemente que se han utilizado para el mapeo de la activación cerebral in vivo. FAS imágenes se aplicó por primera vez a la corteza somatosensorial de roedores en respuesta a la estimulación por la pata trasera del grupo Katsuei Shibuki 4. El sistema olfativo es de vital importancia para la supervivencia de la gran mayoría de las especies vivas, ya que permite la detección eficaz y la identificación de sustancias químicas en el medio ambiente (alimentos, los depredadores). El OB es el primer relé de procesamiento de la información olfativa en el cerebro. Que recibe proyecciones aferentes del olfato neuronas sensoriales primarias que detectan las moléculas odoríferas volátiles. Cada neurona sensorial se expresa sólo un tipo de receptor odorífero y las neuronas que lleva el mismo tipo de receptor envían sus procesos del nervio al mismo bien definida microrregiones de ~ 100μm 3 constituido por neuropilo discreto, el olfato glomérulos (Fig. 1). En la última década, el IOS de imagen ha fomentado la exploración funcional del OB 5, 6, 7, que se ha convertido en una de las estructuras sensoriales más estudiadas. El mapeo de la actividad de OB con el FAS de imagen no se ha realizado todavía. En este caso, we muestran los pasos sucesivos de un protocolo eficiente para IOS y las imágenes de mapa de FAS olor evoca las actividades en el OB de ratón.

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Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

Este artículo presenta los protocolos de la intrínseca señales ópticas y señales de autofluorescencia flavoproteínas imágenes de mapa de olor evoca las actividades en la superficie del bulbo olfatorio de los ratones.

Actividades de imagen de olores provocados en el bulbo olfatorio de ratón utilizando reflexión óptica y señales de autofluorescencia

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

imaging-odor-evoked-activities-mouse-olfactory-bulb-using-optical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.9K vistas.  UMR8165 Université Paris Sud 11, Paris Diderot 7 – CNRS. Este artículo presenta los protocolos de la intrínseca señales ópticas y señales de autofluorescencia flavoproteínas imágenes de mapa de olor evoca las actividades en la superficie del bulbo olfatorio de los ratones.

Video: Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Las respuestas de los análisis de las neuronas sensoriales olfativas ratón Utilizando la grabación Electroolfactogram Aire fase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Investigación

Neurociencias

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Múltiples imágenes del ratón neuroanatómicos de Resonancia Magnética

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Orientación neuronas del bulbo olfativo uso combinado En Vivo La electroporación y Gal4 basado reforzador líneas trampa de pez cebra

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

El calcio de la imagen del olor de respuestas evocadas en el Drosophila Lóbulo antenal

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo la Producción de la Bombilla órgano vomeronasal y accesorios olfativa Intacto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Grabación de la actividad neuronal inducida por temperatura a través de la supervisión de cambios de calcio en el bulbo olfatorio de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system. This system is constructed from a broadband white light source, a motorized filter wheel with a set of narrowband interference filters, a light guide, a collecting lens, a video zoom lens, and a monochromatic charged-coupled device (CCD) camera. An ellipsoidal cranial window is made in the skull bone of a rat under isoflurane anesthesia to capture in vivo multispectral diffuse reflectance images of the cortical surface. Regulation of the fraction of inspired oxygen using a gas mixture device enables the induction of different respiratory states such as normoxia, hyperoxia, and anoxia. A Monte Carlo simulation-based multiple regression analysis for the measured multispectral diffuse reflectance images at nine wavelengths (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, and 760 nm) is then performed to visualize the two-dimensional maps of hemodynamics and the light scattering properties of the in vivo rat brain.

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional multispectral diffuse reflectance imaging system.

La evaluación simultánea de Hemodinámica cerebral y propiedades de dispersión de luz de la<em&gt; En Vivo</em&gt; Cerebro de rata utilizando multiespectral de imágenes de reflectancia difusa

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomografía de coherencia óptica: Proyección de imagen de ratón ganglionares de la retina las células In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Imunocoloración Cuádruple del Bulbo Olfativo para la Visualización de Códigos de Identidad Molecular del Axón Sensorial Olfativo

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the substantia nigra, is essential. To estimate the total dopaminergic neuron number, unbiased stereology using the optical fractionator method is currently considered the gold standard. Because the theory behind the optical fractionator method is complex and because stereology is difficult to achieve without specialized equipment, several commercially available complete stereology systems that include the necessary software do exist, purely for cell counting reasons. Since purchasing a specialized stereology setup is not always feasible, for many reasons, this report describes a method for the stereological estimation of dopaminergic neuronal cell counts using standard microscopy equipment, including a light microscope, a motorized object table (x, y, z plane) with imaging software, and a computer for analysis. A step-by-step explanation is given on how to perform stereological quantification using the optical fractionator method, and pre-programmed files for the calculation of estimated cell counts are provided. To assess the accuracy of this method, a comparison to data obtained from a commercially available stereology apparatus was performed. Comparable cell numbers were found using this protocol and the stereology device, thus demonstrating the precision of this protocol for unbiased stereology.

This work presents a step-by-step protocol for the unbiased stereological estimation of dopaminergic neuronal cell numbers in the mouse substantia nigra using standard microscopy equipment (i.e., a light microscope, a motorized object table (x, y, z plane), and public domain software for digital image analysis.

Estereológicos estimación de número de la neurona dopaminérgica en el Nigra del Substantia de ratón usando el fraccionador óptico y equipo de microscopía estándar

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...