Los autores desean agradecer a las siguientes personas por financiar este trabajo: generoso arranque fondos del Departamento de Ingeniería Biomédica en la Universidad de Washington, un Centro de Neurociencia de Sistemas McDonnell subvención, una Oficina de Investigación Naval de subvención (Grant #: N000141210089) para BR

1. Olor Preparación y entrega <ol><li> Las soluciones diluidas de olor en aceite mineral en volumen para alcanzar el nivel de concentración deseado. Almacene una mezcla de 20 ml de aceite mineral y el olor en un frasco de vidrio de 60 ml. Insertar dos agujas de jeringa en un tapón de goma (calibre 19), una de la parte inferior y la otra desde la parte superior, para proporcionar una entrada y una línea de salida. Sellar la botella de vidrio con tapón de caucho y este adjuntar un diseño personalizado filtro de carbón activado a la línea de entrada (Figura 1A). </li><li> El filtro de carbono se hace utilizando dos jeringas 6 ml. Cortar las jeringas en la mitad y descartar el extremo del émbolo. Rellenar cada una de las piezas restantes con algodón y carbón activado antes de conectar juntos utilizando calor tubo retráctil. </li><li> Conectar la línea de salida de la botella de olor (con tubo de polietileno, ID 0,86 mm) para el tubo de plástico (Nalgene Tubos FEP, ID 5,8 mm) que suministra un flujo de aire constante a través de la antena (Figura 1B </strong&gt;). </li><li> Directo carbono-filtrada, aire deshumidificado (gas portador; caudal, 0,75 L / min) hacia la langosta usando un tubo de plástico que se coloca dentro de unos pocos cm de la antena de la langosta. </li><li> Para la estimulación olor, desplazar un volumen constante (0,1 L / min) de la cámara de aire estática por encima de la solución de olor en la botella. Esto se consigue mediante la inyección de una cantidad igual de aire deshumidificado en el frasco utilizando un Pico-bomba (WPI, PV-820). Los vapores de la botella de olor se dirige a través de la línea de salida en el tubo de flujo de aire (Figura 1B). </li><li> Retire los vapores de olor entregados mediante la colocación de un embudo vacío ~ 10 cm detrás de la antena contra la langosta. </li></ol> 2. Preparación para la grabación de Antena Locust sensillum individual <ol><li> Seleccione una langosta de adultos jóvenes de ambos sexos con alas totalmente crecido, pero antes de la etapa de apareamiento de una colonia llena de gente. Para frenar la langosta, en primer lugar amputar las piernas. Selle los sitios de amputación con adhesivo tisular (Vetbond, 3M). Secure tél langosta a una cámara de diseño personalizado con un pequeño trozo de cinta aislante envuelto alrededor de su tórax (Figura 2A). </li><li> Bajo un microscopio de disección, hacer una ranura poco profunda en la plataforma de cera (Figura 2A) para la colocación de la antena. Coloque la antena en la ranura y estabilizar usando cera batik en los dos extremos de la antena (Figura 2B; una electrowaxer se utiliza para la fusión de la cera). </li><li> Inserte un electrodo de tierra (alambre de plata clorada) en el tórax (~ 1 cm de distancia de la cabeza). Use cera batik tanto el sello del sitio de la incisión y mantenga el cable de tierra en su lugar (Figura 2A). </li></ol> 3. Grabación sensillum Individual de Seguimiento de olor-evocó las respuestas de las neuronas receptoras olfativas (ORNs) <ol><li> Coloque la antena langosta estabilizado bajo un microscopio estereoscópico (Leica M205C) en una tabla de aislamiento de vibraciones (TMC) (Figura 3A). Asegúrese de que la base de la sensillum grabación es claraLy visible (Figura 3B). </li><li> Use un extractor de micropipeta (Sutter P-1000) para la fabricación de electrodos de vidrio (impedancia de 3-10 mW cuando se llena con solución salina 9 langosta, m diámetro de la punta 1-3) utilizando un tubo capilar de vidrio de borosilicato (OD 1,2 mm, ID 0,69 mm). </li><li> Coloque el electrodo de vidrio en un soporte micropipeta que está unido a un micromanipulador motorizado (Sutter MP-285). Suavemente insertar el electrodo en la base de un sensillum (Figura 3B). Tenga en cuenta que cada sensillum puede contener 3-50 ORNs en langostas 10. </li><li> Amplificar la señal (10.000 veces) utilizando un amplificador AC (Grass P-55). Filtrar la señal de entre 0,3 a 10,0 kHz y adquirir a una velocidad de muestreo de 15 kHz (Figura 3D) usando un sistema de adquisición de datos (LabView, PCI-MIO-16E-4 tarjetas DAQ; National Instruments). </li></ol> 4. Locust Procedimiento para la disección del lóbulo antenal y grabaciones de setas del cuerpo <ol><li> Siga el restrainiprocedimientos ng como se describe en la sección 2.1. Coloque la langosta en una cámara diseñada a tal como se muestra en la Figura 4A y B. </li><li> Para la perfusión de solución salina durante y después del procedimiento de disección, construir una taza de cera alrededor de la cabeza de la langosta. La taza de cera debe comenzar justo por encima de las partes de la boca, y se extienden más allá de los ojos compuestos que abarca la región entre las dos antenas como se muestra en la Figura 4C. </li><li> Para permitir que las antenas para pasar a través de la copa de cera, crear pequeños túneles en ambos lados con plástico (polietileno) tubo (5 mm de largo, 0,86 mm ID). Asegúrese de que el tubo de plástico se puede deslizar a través de la copa de cera. Esto último se logra mediante el uso de una junta de goma que envuelve herméticamente alrededor del tubo de plástico, pero está unido a la cera-taza (Figura 4C). </li><li> Uso de resina epoxi, una la base de las antenas con el extremo inferior del tubo de plástico. Este paso asegura que las antenas se mantiene en su lugar, incluso después de los alrededorescutícula se retira. </li><li> Mantenga la copa cera llena con solución salina 9 desde este punto en adelante. Comenzar por la eliminación de una región rectangular central entre las dos antenas (lado más largo del rectángulo alineado con el eje anteroposterior). Posteriormente, retirar cutícula en las regiones vecinas sin molestar a los ojos compuestos y cutícula en la base de la antena (Figura 4D). </li><li> Con unas pinzas finas, retire suavemente sacos de aire y los cuerpos grasos que rodean el cerebro. Al final de este paso, el cerebro langosta debe ser visto claramente (Figura 4D). Nótese que las regiones del cerebro que procesan la información olfativa (con pigmentación amarillo claro) está situado entre las dos antenas. </li><li> En el intestino langostas pasa por debajo del cerebro y a lo largo de la longitud del cuerpo. Para evitar el movimiento de los intestinos de potencialmente desestabilizar la preparación, tire suavemente del intestino anterior y lo cortó con unas tijeras finas. Haga una pequeña incisión en el abdomen justopor encima del recto y quitar el intestino tirando del intestino posterior con pinzas gruesas. Para evitar una fuga de solución salina, atar el abdomen inmediatamente anterior al sitio de la incisión con hilos de sutura. </li><li> Utilice una pequeña plataforma hecha de un alambre fino recubierto con una fina capa de cera para elevar el cerebro y estabilizarla durante 11 electrofisiología como se muestra en la Figura 4D. </li><li> El cerebro de los insectos está cubierto por una funda aislante delgada que necesita ser eliminado antes de los experimentos. Para desheath el cerebro, se extendió suavemente una pequeña cantidad de una enzima (0.3-0.4 mg de proteasa, Sigma Aldrich) sobre la superficie del cerebro utilizando unas pinzas finas 9. Después de s ~ 5-10 de aplicación de enzima, enjuagar el cerebro a fondo con solución salina. Con super-finas pinzas muy suavemente pellizcar y tirar de la vaina y posteriormente romper abrirlo en los lugares de grabación (AL y MB, se muestra en la Figura 4E, F). </li></ol> 5. Grabaciones de varias unidades del lóbulo antenal yel Consejo de la seta <ol><li> Colocar la preparación langosta (Figura 5A) bajo un estereomicroscopio suspendido de un soporte de brazo colocado sobre una mesa de aislamiento de vibraciones. </li><li> Mantener un ritmo constante de perfusión de solución salina (aproximadamente 0,04 L / h) durante todo el experimento. Usar un cable de plata clorada sumergido en la taza de cera lleno de solución salina como el electrodo de tierra. </li><li> Para las grabaciones PN, utiliza un 16-canal de silicio sonda (Tecnologías NeuroNexus, artículo # a2x2-tet-3mm-150-150-121-A16, Figura 5B). Antes de cada experimento, electrochapar los electrodos de oro para conseguir impedancias en el rango de 200-300 kW. Utilice el circuito mostrado en la Figura 7 para la galvanoplastia. </li><li> Coloque el electrodo cerca de la superficie del lóbulo antenal y suavemente insertar en el tejido usando un micromanipulador manual (WPI, M3301R) (Figura 5D). </li><li> Haga avanzar el electrodo en ~ 10 pasos micras. Espere 2-3 minutos en cada paso y evaluar la adquisición ded calidad de la señal. En un sitio de grabación ideal, señales extracelulares será recogido por múltiples canales de grabación y tendrá una alta relación señal a ruido (SNR&gt; 3-5 veces el ruido de las desviaciones estándar). </li><li> Para grabaciones de KC, use un tetrodo medida alambre trenzado (Figura 5C, paso a paso el procedimiento de fabricación presentan en la Sección 6). Electrochapar estos electrodos como se discute en el paso 5,3. Coloque el tetrodo en la superficie de la MB (Figura 5E) como KC somata están restringidas a la capa superficial de la MB 8. </li><li> Tanto PN y grabaciones KC se puede hacer al mismo tiempo de preparación langosta del mismo como se muestra esquemáticamente en la Figura 5A. </li><li> Espere por lo menos 15 min después de encontrar la ubicación de grabación para permitir la estabilización de los electrodos. </li><li> Adquirir todas las señales extracelulares a 15 KHz, filtro entre 0.3-6 KHz, y amplificar (10.000 veces) usando un amplificador de 16 canales AC (Biología Electronics Shop; Caltech, Pasadena, CA) (La Figura 6A, B). </li></ol> 6. Procedimientos para hacer electrodo de alambre trenzado para grabaciones de KC <ol><li> Para diseñar un electrodo de múltiples unidades para las grabaciones de KC, utilice cable aislado cromo níquel (RO800, 0,0005 &quot;filamento) 8. </li><li> Si se desean ocho electrodos luego envolver el alambre alrededor de un pedazo largo de 10-15 cm de cartón 4 veces. Los extremos de la cartulina puede ser cubierta con un tubo de plástico para evitar que los bordes de corte del alambre. Si bien el embalaje, asegúrese de que hay poco flojo, pero asegúrese de que el cable no quede tirante. Manipule el cable con cuidado, ya que se rompe fácilmente. </li><li> Bunch los cables juntos en la parte superior del cartón y usar un trozo de cinta (cinta de tiempo, T-534-RP) para mantenerlos juntos. Cortar los cordones en el otro extremo. Quitar los hilos de alambre y el grupo de los hilos en el extremo de corte, así utilizando otra pieza de la cinta. </li><li> El uso de un título agitador de placas (Thermo Scientific, Modelo 4625Q), el viento los hilos juntos (~ 72 rev / min durante 3min) para formar un hilo trenzado. La parte inferior de las hebras grabadas puede ser recortado a la placa de titulación de rotor y la parte superior se puede enganchar a un soporte de la pluma. Durante el bobinado, el cable debe tener poco flojo, pero no estar tensada. </li><li> Fundir el aislamiento junto con una pistola de calor (Weller 6966C) para pegar los filamentos individuales entre sí y forman un solo cable. 3-4 pases lentos (3-4 segundos cada uno) sobre la longitud del alambre debe ser suficiente para calentar y fundir los hilos juntos. A continuación, suelte el cable desde la parte inferior y permitir que se relaje. Recorte el cable cerca de los extremos para quitar la cinta. </li><li> Insertar un extremo del cable a través de un tubo de vidrio de 5-6 cm de largo, capilar (OD 1,0 mm, ID 0,58 mm). Separar el alambre retorcido en un extremo con unas pinzas finas y eliminar el recubrimiento por muy brevemente quemando el extremo usando una llama. Este paso debe realizarse con cuidado; exponer el alambre a la llama durante demasiado tiempo hará que las hebras para fundir y enredo. </li><li> Suavemente separar las hebras 8 en el extremo de un flameadond soldadura cada capítulo por separado en una conexión de 8-pin IC. Escudo de la parte superior de la toma de IC con epoxi para mantener los filamentos de vidrio capilar y en su lugar. También coloque una pequeña gota de epoxi en el otro extremo del capilar para mantener el cable en su sitio (Figura 5C). </li><li> Por último, cortar la punta de la aguja en un ángulo de 45 grados con tijeras carburo de aproximadamente 0,5 cm de la punta capilar. </li></ol>

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G., Joerges, J., Kuttner, A., Faber, T., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-in-vivo+preparation+for+optical+recording+of+the+insect+brain.">A semi-in-vivo preparation for optical recording of the insect brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 76, 61-69 (1997).</li><li>Galan, R. F., Sachse, S., Galizia, C. G., Hez, A. V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odor-driven+attractor+dynamics+in+the+antennal+lobe+allow+for+simple+and+rapid+olfactory+pattern+classification.">Odor-driven attractor dynamics in the antennal lobe allow for simple and rapid olfactory pattern classification.</a> Neural Computation. 16, 999-1012 (2004).</li><li>Kuebler, L. S., Schubert, M., Karpati, Z., Hansson, B. S., Olsson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antennal+Lobe+Processing+Correlates+to+Moth+Olfactory+Behavior.">Antennal Lobe Processing Correlates to Moth Olfactory Behavior.</a> Journal of Neuroscience. 32, 5772-5782 (2012).</li><li>Silbering, A. F., Bell, R., Galizia, C. G., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Imaging+of+Odor-evoked+Responses+in+the+Drosophila+Antennal+Lobe.">Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe.</a> J. Vis. Exp. (61), e2976 (2012).</li><li>Skiri, H. T., Galizia, C. 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No hay conflictos de interés declarado.

Estímulos sensoriales más evocan respuestas combinatorias que se distribuyen a través de conjuntos de neuronas. Por lo tanto, la supervisión simultánea de múltiples neurona actividad es necesario entender como estímulo específico de información está representada y procesada por los circuitos neurales en el cerebro. En este caso, hemos demostrado extracelulares unitarios múltiples técnicas de grabación para caracterizar el mal olor respuestas evocadas en los centros de procesamiento de los tres primeros lo l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Electrofisiología Equipo </td></tr><tr><td> AC amplificador </td><td> HIERBA </td><td> Modelo P55 </td><td> para las grabaciones individuales sensillum </td></tr><tr><td> Audio monitor (modelo 3300) </td><td> Sistemas AM </td><td> 940000 </td><td></td></tr><tr><td> Por encargo de 16 canales pre-amplificador y amplificador </td><td> Cal. Tech. Biología Electronics Shop </td><td></td><td> para las grabaciones de AL y MB </td></tr><tr><td> Unidad de adquisición de datos </td><td> National Instruments </td><td> BNC-2090 </td><td></td></tr><tr><td> Luz de fibra óptica </td><td> WPI </td><td> SI-72-8 </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Fuente de luz 115 V </td><td> WPI </td><td> NOVA </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulador Manual </td><td> WPI </td><td> M3301R </td><td> para las grabaciones del cerebro de langosta </td></tr><tr><td> Stereomicroscope1 en el stand de la pluma </td><td> Leica </td><td> M80 </td><td> para las grabaciones del cerebro de langosta </td></tr><tr><td> Stereomicroscope2 </td><td> Leica </td><td> M205C </td><td> para las grabaciones individuales sensillum </td></tr><tr><td> Aislamiento de vibraciones mesa </td><td> TMC </td><td> 63-500 serie </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulador motorizado </td><td> Sutter Instruments </td><td> MP285 / T </td><td></td></tr><tr><td> Osciloscopio </td><td> Tektronix </td><td> TD2014B </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Electrodos / Herramientas de Construcción &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> 16-canal de electrodo </td><td> NeuroNexus </td><td> A2x2-tet-3mm-150-121 </td><td> para las grabaciones de lóbulo antenal </td></tr><tr><td> Tubos capilares de borosilicato con filamento, ID 0,69 mm </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF120-69-10 </td><td> para la fabricación de electrodos de vidrio </td></tr><tr><td> Micropipetas extractor </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-1000 </td><td></td></tr><tr><td> El generador de funciones </td><td> Multímetro Almacén </td><td> SG1639A </td><td> para electrodos de sobrerregulación </td></tr><tr><td> Oro solución de chapado (no cianuro) </td><td> Industrias SIFCO </td><td> NC SPS 5355 </td><td></td></tr><tr><td> Impedancia probador </td><td> BAK Electronics Inc. </td><td> IMP-2 </td><td> para electrodos de sobrerregulación </td></tr><tr><td> Rotary Switch </td><td> Electroswitch </td><td> C7D0123N </td><td> para el oro-plnamiento electrodos </td></tr><tr><td> Pulse aislador </td><td> WPI </td><td> A365 </td><td> para electrodos de sobrerregulación </td></tr><tr><td> Q serie portaelectrodos </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-1091 </td><td></td></tr><tr><td> Alambre de plata .010 &quot;de diámetro </td><td> Sistemas AM </td><td> 782500 </td><td> electrodo de masa </td></tr><tr><td> 8 pin DIP socket IC </td><td> Digikey </td><td> ED90032-ND </td><td></td></tr><tr><td> Tubos capilares de borosilicato con filamento, ID 0,58 mm </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0787 </td><td> alambre trenzado construcción tetrodo </td></tr><tr><td> Heat gun </td><td> Weller </td><td> 6966C </td><td></td></tr><tr><td> Rediohm-800 cable </td><td> Kanthal Precision Tecnologías </td><td> PF002005 </td><td></td></tr><tr><td> Titer agitador de placas </td><td> ThermoCientífico </td><td> 4625Q </td><td> alambres retorcidos </td></tr><tr><td> Carburo de tijeras, 4,5 &quot; </td><td> Investigación Biomédica Instr </td><td> 25-1000 </td><td> para el corte de cables trenzados tetrodo </td></tr><tr><td> Pinzas de punta fina </td><td> HECO </td><td> 91-EF5-SA </td><td> para cables tetrodo bromas aparte </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Olor de entrega </td></tr><tr><td> 6 ml jeringa </td><td> Kendall </td><td> 1180600777 </td><td> diseñado para filtro de carbón activado </td></tr><tr><td> Botellas de color marrón de olor </td><td> Pescador </td><td> 08-912-165 </td><td></td></tr><tr><td> Carbón </td><td> <a href="http://BuyActivatedCharcoal.com" target="_blank">BuyActivatedCharcoal.com</a> </td><td> GAC-48C </td><td></td></tr><tr><td> Desecante </td><td> Drierite </td><td> 23005 </td><td></td></tr><tr><td> Gas Drierite secado tarro </td><td> Fischer Scientific </td><td> 09-204 </td><td></td></tr><tr><td> Tubo termorretráctil </td><td> 3M </td><td> EPS-200 </td><td> olor filtro preparación </td></tr><tr><td> Aguja hipodérmica buje de aluminio, calibre 19 </td><td> Kendall </td><td> 8881-200136 </td><td> para proporcionar líneas de entrada y de salida para las botellas de olor </td></tr><tr><td> Aceite mineral </td><td> Mallinckrodt Químicos </td><td> 6357-04 </td><td> para la dilución olor </td></tr><tr><td> Nalgene plástico tubo, 890 FEP </td><td> Thermo Scientific </td><td> 8050-0310 </td><td> para el suministro de gas portador </td></tr><tr><td> Neumático picopump </td><td> WPI </td><td> sistema de pv820 </td><td> para la entrega de olor </td></tr><tr><td> Tubería de polietileno de 0,86 mm ID </td><td> Intramedic </td><td> 427421 </td><td> para el olor botella connecti salidaComplementos y tubos profusión salina </td></tr><tr><td> Tapones </td><td> Pure Lab </td><td> 97041 </td><td> para el sellado de botellas de olor </td></tr><tr><td> Tiempo de cinta </td><td> PDC </td><td> T-534-RP </td><td></td></tr><tr><td> Tubería luer </td><td> Cole-Parmer </td><td> 30600-66 </td><td></td></tr><tr><td> Tubo vacío </td><td> McMaster-Carr </td><td> 5488K66 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Preparación / Disección </td></tr><tr><td> 100 x 15 mm plato petri </td><td> VWR International </td><td> 89000-304 </td><td></td></tr><tr><td> 18 AWG cable trenzado de cobre </td><td> Lapp Kabel </td><td> 4510013 </td><td> aislamiento de los cables se utiliza como juntas de goma </td></tr><tr><td> 22 AWG cable para conexión de cadena </td><td> Alphawire </td><td> 1551 </td><td> cerebroplataforma </td></tr><tr><td> Batik cera </td><td> Jacquard </td><td> 7946000 </td><td></td></tr><tr><td> Cera de periferia Dental </td><td> Henry Schein Dental- </td><td> 6652151 </td><td></td></tr><tr><td> Electrowaxer </td><td> Almore Internacional </td><td> 66000 </td><td></td></tr><tr><td> Epoxy, 5 min </td><td> Permatex </td><td> 84101 </td><td></td></tr><tr><td> Aguja hipodérmica buje de aluminio </td><td> Kendall </td><td> 8881-200136 </td><td></td></tr><tr><td> Proteasa de Streptomyces griseus </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5147 </td><td> para desheathing cerebro langosta </td></tr><tr><td> Sutura rosca no estéril </td><td> Pescador </td><td> NC9087024 </td><td> para atar el abdomen después de la eliminación intestinal </td></tr><tr><td> Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469SB </td><td> para sellar amsitios de amputación </td></tr><tr><td> Dumont # 1 pinza (grueso) </td><td> WPI </td><td> 500335 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 pinzas de titanio (muy bien) </td><td> WPI </td><td> 14096 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5SF fórceps (super-fino) </td><td> WPI </td><td> 500085 </td><td> desheathing cerebro langosta </td></tr><tr><td> 10 cm Tijeras de disección </td><td> WPI </td><td> 14393 </td><td> para retirar las patas y las alas </td></tr><tr><td> Tijeras Vannas (bien) </td><td> WPI </td><td> 500086 </td><td> para retirar cutícula, cortando el intestino anterior </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Profusión Saline </td></tr><tr><td> Juego de extensión con regulador de caudal </td><td> Moore Medical </td><td> 69136 </td><td> para regular el flujo de solución salina </td></tr><tr><td> IV equipo de administración conY el sitio de inyección </td><td> Moore Medical </td><td> 73190 </td><td> para regular el flujo de solución salina </td></tr></tbody></table>

multi-unit recording methods to characterize neural activity in the locust (schistocerca americana) olfactory circuits

La detección e interpretación de señales olfativas son críticos para la supervivencia de muchos organismos. Cabe destacar que las especies a través de phyla han sistemas olfativos sorprendentemente similares sugiere que el enfoque biológico para la detección química ha sido optimizada en el tiempo evolutivo 1. En el sistema olfativo de insectos, sustancias odoríferas son transducidas por neuronas receptoras olfativas (ORN) en la antena, que convierten los estímulos químicos en los trenes de potenciales de acción. La información sensorial desde los ORNs entonces se retransmite al lóbulo antenal (AL; una estructura análoga a la del bulbo olfatorio de vertebrados). En la Liga Americana, representaciones neurales de los olores en forma de patrones de disparo espacio-temporales distribuidos a través de conjuntos de neuronas principales (PN, también conocida como las neuronas de proyección) 2,3. La salida AL se procesa posteriormente por células de Kenyon (KCS) en el cuerpo de hongo aguas abajo (MB), una estructura asociada con la memoria y el aprendizaje olfativo 4,5. Ellae, se presentan técnicas electrofisiológicas de registro para controlar el mal olor respuestas evocadas en estos circuitos neuronales olfatorios. En primer lugar, se presenta un método sensillum sola grabación para estudiar el mal olor respuestas evocadas en el nivel de las poblaciones de ORNs 6,7. Se discute el uso de pipetas de vidrio llenos de solución salina afilados como electrodos para monitorear las respuestas ORN extracelularmente. A continuación, se presenta un método para monitorear las respuestas extracelularmente PN utilizando un canal comercial 16-electrodo 3. Un enfoque similar utilizando un tetrodo alambre a medida 8-canal trenzado se demuestra para células Kenyon grabaciones 8. Nosotros proporcionamos detalles de nuestra configuración experimental y presentes trazas de grabación representativos para cada una de estas técnicas.

Respuestas evocadas olor-de una sola ORN a dos alcoholes diferentes se muestran en la Figura 3D. Dependiendo de la ubicación de la grabación (tipo sensilla, la colocación del electrodo) de unidades múltiples grabaciones se puede lograr. Una forma de onda prima extracelular de una grabación de AL se muestra en la Figura 6A. Los potenciales de acción o picos de amplitudes variables procedentes de PN diferentes se puede observar en esta traza de tensión....

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Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Demostramos variaciones de la técnica de grabación extracelular de múltiples unidades para caracterizar el mal olor respuestas evocadas en las tres primeras etapas de la vía olfativa invertebrado. Estas técnicas se pueden adaptar fácilmente para examinar la actividad conjunto en otros sistemas neurales también.

Varias unidades Métodos de grabación para caracterizar la actividad neuronal en el Locust (<em&gt; Schistocerca americana</em&gt;) Circuitos olfativas

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

multi-unit-recording-methods-to-characterize-neural-activity-locust

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

26.8K vistas.  Washington University in St. Louis. Demostramos variaciones de la técnica de grabación extracelular de múltiples unidades para caracterizar el mal olor respuestas evocadas en las tres primeras etapas de la vía olfativa invertebrado. Estas técnicas se pueden adaptar fácilmente para examinar la actividad conjunto en otros sistemas neurales también.

Video: Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery. Here we provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting electrode systems. We demonstrate the implantation procedure of both a penetrating and a surface electrode. The surgical process is described from start to finish, including detailed descriptions of each step throughout the procedure. It should also be noted that this video guide is focused towards procedures conducted in rodent models and other small animal models. Modifications of the described procedures are feasible for other animal models.

We provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting chronic neural recording electrodes. Techniques for both penetrating and surface electrode systems are described in a rodent animal model.

La implantación quirúrgica de electrodos neuronales crónicas para registrar la actividad y señales de una sola unidad electrocorticográfica

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Investigación

Neurociencias

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also propagation of suprathreshold spiking activity involves populations of neurons. Empirical studies addressing cortical function directly thus require recordings from populations of neurons with high resolution. Here we describe an optical method and a deconvolution algorithm to record neural activity from up to 100 neurons with single-cell and single-spike resolution. This method relies on detection of the transient increases in intracellular somatic calcium concentration associated with suprathreshold electrical spikes (action potentials) in cortical neurons. High temporal resolution of the optical recordings is achieved by a fast random-access scanning technique using acousto-optical deflectors (AODs)1. Two-photon excitation of the calcium-sensitive dye results in high spatial resolution in opaque brain tissue2. Reconstruction of spikes from the fluorescence calcium recordings is achieved by a maximum-likelihood method. Simultaneous electrophysiological and optical recordings indicate that our method reliably detects spikes (&gt;97% spike detection efficiency), has a low rate of false positive spike detection (&lt; 0.003 spikes/sec), and a high temporal precision (about 3 msec) 3. This optical method of spike detection can be used to record neural activity in vitro and in anesthetized animals in vivo3,4.

Understanding the function of the vertebrate central nervous system requires recordings from many neurons because cortical function arises on the level of populations of neurons. Here we describe an optical method to record suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution, dithered random-access scanning. This method records somatic fluorescence calcium signals from up to 100 neurons with high temporal resolution. A maximum-likelihood algorithm deconvolves the underlying suprathreshold neural activity from the somatic fluorescence calcium signals. This method reliably detects spikes with high detection efficiency and a low rate of false positives and can be used to study neural populations in vitro and in vivo.

Grabación óptica de la actividad neural suprathreshold con la resolución de una sola célula y único punta-

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

All organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is especially important in insects, which use their olfactory systems to respond to, and discriminate amongst, complex odor stimuli. These odors elicit behaviors that mediate processes such as reproduction and habitat selection1-3. Additionally, chemical sensing by insects mediates behaviors that are highly significant for agriculture and human health, including pollination4-6, herbivory of food crops7, and transmission of disease8,9. Identification of olfactory signals and their role in insect behavior is thus important for understanding both ecological processes and human food resources and well-being.
	To date, the identification of volatiles that drive insect behavior has been difficult and often tedious. Current techniques include gas chromatography-coupled electroantennogram recording (GC-EAG), and gas chromatography-coupled single sensillum recordings (GC-SSR)10-12. These techniques proved to be vital in the identification of bioactive compounds. We have developed a method that uses gas chromatography coupled to multi-channel electrophysiological recordings (termed 'GCMR') from neurons in the antennal lobe (AL; the insect's primary olfactory center)13,14. This state-of-the-art technique allows us to probe how odor information is represented in the insect brain. Moreover, because neural responses to odors at this level of olfactory processing are highly sensitive owing to the degree of convergence of the antenna's receptor neurons into AL neurons, AL recordings will allow the detection of active constituents of natural odors efficiently and with high sensitivity. Here we describe GCMR and give an example of its use.
	Several general steps are involved in the detection of bioactive volatiles and insect response. Volatiles first need to be collected from sources of interest (in this example we use flowers from the genus Mimulus (Phyrmaceae)) and characterized as needed using standard GC-MS techniques14-16. Insects are prepared for study using minimal dissection, after which a recording electrode is inserted into the antennal lobe and multi-channel neural recording begins. Post-processing of the neural data then reveals which particular odorants cause significant neural responses by the insect nervous system.
	Although the example we present here is specific to pollination studies, GCMR can be expanded to a wide range of study organisms and volatile sources. For instance, this method can be used in the identification of odorants attracting or repelling vector insects and crop pests. Moreover, GCMR can also be used to identify attractants for beneficial insects, such as pollinators. The technique may be expanded to non-insect subjects as well.

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings GCMR in the Insect Antennal Lobe

Olfactory cues mediate many different behaviors in insects, and are often complex mixtures comprised of tens to hundreds of volatile compounds. Using gas chromatography with multi-channel recording in the insect antennal lobe, we describe a method for the identification of bioactive compounds.

La identificación de los compuestos volátiles olfativas utilizando cromatografía de gases-de varias unidades Grabaciones (GCMR) en el lóbulo antenal insectos

All  organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their  behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, including rats, hamsters, and mice, are active during the night and relatively inactive during the day. Many other behavioral and physiological measures also exhibit daily rhythms, but in rodents, running-wheel activity serves as a particularly reliable and convenient measure of the output of the master circadian clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. In general, through a process called entrainment, the daily pattern of running-wheel activity will naturally align with the environmental light-dark cycle (LD cycle; e.g. 12 hr-light:12 hr-dark). However circadian rhythms are endogenously generated patterns in behavior that exhibit a ~24 hr period, and persist in constant darkness. Thus, in the absence of an LD cycle, the recording and analysis of running-wheel activity can be used to determine the subjective time-of-day. Because these rhythms are directed by the circadian clock the subjective time-of-day is referred to as the circadian time (CT). In contrast, when an LD cycle is present, the time-of-day that is determined by the environmental LD cycle is called the zeitgeber time (ZT).
Although circadian rhythms in running-wheel activity are typically linked to the SCN clock6-8, circadian oscillators in many other regions of the brain and body9-14 could also be involved in the regulation of daily activity rhythms. For instance, daily rhythms in food-anticipatory activity do not require the SCN15,16 and instead, are correlated with changes in the activity of extra-SCN oscillators17-20. Thus, running-wheel activity recordings can provide important behavioral information not only about the output of the master SCN clock, but also on the activity of extra-SCN oscillators. Below we describe the equipment and methods used to record, analyze and display circadian locomotor activity rhythms in laboratory rodents.

Circadian rhythms in voluntary wheel-running activity in mammals are tightly coupled to the molecular oscillations of a master clock in the brain. As such, these daily rhythms in behavior can be used to study the influence of genetic, pharmacological, and environmental factors on the functioning of this circadian clock.

Registro y análisis de los ritmos circadianos en funcionamiento las ruedas Actividad en roedores

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

Optogenética perturbación de la actividad neuronal con la iluminación láser en semi-intacta<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house single or multiple neurons inside, are considered to make the major contribution in responding to the chemical stimuli. By directly recording action potential in the olfactory sensillum after exposure to stimuli, single sensillum recording (SSR) technique provides a powerful approach for investigating the neural responses of insects to chemical stimuli. For the bed bug, which is a notorious human parasite, multiple types of olfactory sensillum have been characterized. In this study, we demonstrated neural responses of bed bug olfactory sensilla to two chemical stimuli and the dose-dependent responses to one of them using the SSR method. This approach enables researchers to conduct early screening for individual chemical stimuli on the bed bug olfactory sensilla, which would provide valuable information for the development of new bed bug attractants or repellents and benefits the bed bug control efforts.

Bed bugs rely on olfactory receptor neurons housed in their antennal olfactory sensilla to detect semiochemicals in the environment. Utilizing single sensillum recording, we demonstrate a method to evaluate bed bug response to semiochemicals and explore the coding process involved.

Uso Individual sensillum grabación para detectar respuestas olfativo neurona de chinches de cama a Semioquímicos

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Extracelular de grabación de la actividad neuronal junto con la aplicación de sustancias Microiontophoretic neuroactivos en ratones Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Grabación de la actividad neuronal inducida por temperatura a través de la supervisión de cambios de calcio en el bulbo olfatorio de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Imunocoloración Cuádruple del Bulbo Olfativo para la Visualización de Códigos de Identidad Molecular del Axón Sensorial Olfativo

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the pathophysiological basis of these diseases, it is necessary to precisely characterize in which way the processing of information is disturbed between the different neuronal parts of the circuit. Using extracellular in vivo electrophysiological recordings, it is possible to accurately delineate neuronal activity within a neuronal network. The application of this method has several advantages over alternative techniques, e.g., functional magnetic resonance imaging and calcium imaging, as it allows a unique temporal and spatial resolution and does not rely on genetically engineered organisms. However, the use of extracellular in vivo recordings is limited since it is an invasive technique that cannot be universally applied. In this article, a simple and easy to use method is presented with which it is possible to simultaneously record extracellular potentials such as local field potentials and multiunit activity at multiple sites of a network. It is detailed how a precise targeting of subcortical nuclei can be achieved using a combination of stereotactic surgery and online analysis of multi-unit recordings. Thus, it is demonstrated, how a complete network such as the hyperdirect cortico-basal ganglia loop can be studied in anesthetized animals in vivo.

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

In this study, the methodology is presented on how to perform multi-site in vivo electrophysiological recordings from the hyperdirect pathway under urethane anesthesia.

Agudo<em&gt; In Vivo</em&gt; Grabaciones electrofisiológicas de potenciales de campo locales y actividad de múltiples unidades de la vía hiperdirecta en ratas anestesiadas

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...