El trabajo fue apoyado en parte por el Instituto Nacional de Salud (R01GM079688, R21RR024439 y R21GM075838), National Science Foundation (CBET 0941055), y la Fundación MSU.

1. El aislamiento de MSC Rata Las células madre mesenquimales fueron aisladas de 6-8 semanas de edad Sprague-Dawley hembra de rata como se describió anteriormente 1, 2. MSC aisladas pueden adherirse a la superficie de plástico y fácilmente se expanden durante el cultivo in vitro. <ol><li> El animal se puso en una cámara de anestesia y anestesiado durante unos cinco minutos. Durante la anestesia, observar el ritmo de la respiración intermitente, y la actividad motora. Quitar el animal de la cámara inmediatamente después de que se detenga la actividad motora y la tasa de parpadeo se convirtió en poco frecuentes. </li><li> Coloque al animal en una estación de operación y matar al animal por dislocación cervical. Corte el fémur y la tibia de las extremidades hacia atrás, quitar la piel y los músculos. </li><li> Ponga los fémures y tibias disecados en el 70% de isopropanol durante unos segundos y la transferencia a D-PBS 1X. </li><li> En un gabinete de bioseguridad, el fémur y la tibia se transfirió a una placa de 10 cm que contiene DMEM. Cada hueso se llevó a cabo luego con las pinzas y los dos extremos se abrieron con una tijera. Coloque una aguja 22G a una jeringa de 3 ml y llenarlo con DMEM, luego vaciar la médula ósea en un tubo de 50 ml mediante la inserción de la aguja en un extremo abierto de los huesos. Repita 2 a 3 veces por cada hueso. Cuando todas las calabazas se han obtenido, resuspender las células y pasar la suspensión de células a través de un filtro de 70μm de células para eliminar los restos de los huesos y los agregados de la sangre. </li><li> Centrifugar las células a 200 g, 4 ° C durante 5 minutos y retirar el sobrenadante por aspiración. Resuspender las células en 25 ml de medio MSC (DMEM con 10% de SFB y 1% de Pen-estreptocócica). 10 ml de suspensión celular se sembró en cada plato de cultivo de 10 cm para un total de dos platos. Mantener las placas de cultivo en un 37 ° C y 5% de CO 2 incubadora de 1 a 2 semanas. Medio se cambió cada 2 o 3 días. </li></ol> 2. Enriquecimiento de MSC Rata Una serie de proteínas de superficie se han utilizado para enriquecer MSC, incluyendo CD54, CD90, CD73, CD105 y CD271 3-5. En nuestro estudio, hemos utilizado CD54 y CD90 como marcadores para enriquecer las MSC de clasificación de células magnéticas. <ol><li> Cuando las células alcanzaron alrededor del 80% de confluencia, se aspira el medio y añadir 4 ~ 5 ml de tripsina-EDTA a cada plato. Ponga los platos de nuevo a la incubadora y se incuba durante unos 5 minutos para permitir que el desprendimiento de células. Una vez que las células fueron separadas, añadir la misma cantidad de medio de cultivo para inactivar la tripsina. Recoger la suspensión de células en un tubo de 15 ml y las células de girar en 200 g, 4 ° C durante 5 minutos. </li><li> Los pasos siguientes describen cómo enriquecer MSC por dos marcadores de superficie CD54 y CD90 de acuerdo con el manual para la separación celular mediante BD IMagnet. Pellet de células se resuspendieron en tampón de tinción de células (3% de SFB inactivado por calor en 1X D-PBS) a 20 millones de células / ml. Biotinilado CD54 anticuerpos (0.25μg por millón de células) y biotina CD90 anticuerpos (0.15μg por millón de células) y se mezcla suavemente con la suspensión celular. Después de la incubación en hielo durante 15 minutos, se lavaron las células marcadas con un exceso de volumen de buffer 1X BD Imag. Las células marcadas se centrifuga a 200 g, 4 ° C durante 5 minutos. </li><li> Vortex la BD Imag partículas estreptavidina profundamente, agregue las partículas 40μl por cada 10 millones de células. Mezclar la partícula con las células marcadas bien e incubar las células a las 6 ~ 12 ° C durante 30 minutos. Esto permite que las partículas de estreptavidina para unirse a la biotina anti-CD54 y anti-CD90, que se une a las proteínas de superficie CD54 y CD90, respectivamente. </li><li> Durante el tiempo de incubación, la etiqueta de un tubo de ensayo de fondo redondo para recoger la fracción positiva. Después de la incubación, llevar el volumen de etiquetado de 20 millones de células / ml con tampón 1X BD Imag y la transferencia de las células marcadas con el tubo de recogida de la fracción positiva. Coloque el tubo de la fracción positiva en el IMagnet BD y lo dejó permanecer durante 6 minutos, luego retire el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio con un tubo de la fracción positiva, todavía en el IMagnet BD. </li><li> Retire el tubo de la fracción positiva de la IMagnet BD y colocarlo sobre hielo. Añadir 1 ml de hielo frío 1X tampón BD Imag y suspender las células mediante una mezcla suave. Coloque el tubo de nuevo en el IMagnet BD y lo dejó permanecer durante 2 o 4 minutos. Eliminar el sobrenadante con una pipeta de vidrio nuevo Pasteur. Repita el lavado como se describe en 2.5, una vez más. </li><li> Retire el tubo de la IMagnet BD y suspender las células en medio de cultivo, las semillas de un frasco de 75 cm 2 para el mantenimiento de las células y un plato de 10 cm de citometría de flujo. </li></ol> 3. Verificación de expresión en la superficie del marcador por citometría de flujo Análisis de citometría de flujo se realizó para comprobar que las células que expresan CD54 obtenidos y CD90. El HSC marcador CD45 fue utilizado para confirmar que el MSC se agotaron las CMH. <ol><li> Cuando las células se vuelven confluentes ~ 80%, trypsinize células con tripsina-EDTA y recoger las células en un tubo de 15 ml. Centrifugar a 200 g, 4 ° C durante 5 minutos para recoger las células. </li><li> Aspirar el sobrenadante y seh células con D-PBS 1X vez. Resuspender las células en un tampón de tinción de células (D-1X PBS que contenía 2% de SFB y 0,05% de azida de sodio) para una concentración final de 5 a 10 millones de células / ml y mantener las células en hielo. Alícuota de 100μl de células en suspensión a los seis tubos etiquetados (1 sólo las células, 2. Control de isotipo IgG2a;.. 3 control de isotipo IgG1, 4 CD45; 5. CD54;.. 6 CD90). </li><li> Agregar controles de isotipo y anticuerpos primarios en las concentraciones adecuadas (IgG2a e IgG1: 20μl por millón de células, CD45: 0.5μg por millón de células, CD54: 0.25μg por millón de células, CD90: 0.15μg por millón de células) e incubar a 4 ° C para 30 minutos. </li><li> Lavar las células con PBS 1X-D dos veces y luego suspender las células en un tampón de 100μl tinción de las células. Añadir SA-PE (estreptavidina-ficoeritrina, use 0.15μg por millón de células) e incubar a 4 ° C durante 30 minutos en la oscuridad. </li><li> Lave las células marcadas con D-PBS 1X dos veces. Resuspender las células en un tampón de 400μl tinción de las células y transferirlos a un tubo Falcon para el análisis de citometría de flujo. </li></ol> 4. La separación de una sola colonia Derivado MSC MSC es una población heterogénea, integrada por diversos subgrupos de población con la forma de células diferentes, la tasa de crecimiento, así como la capacidad de diferenciación 6. Sin embargo, todas las subpoblaciones expresan los marcadores MSC conocidas y por lo tanto no es factible el uso de marcadores para separar estas subpoblaciones. Por lo tanto, hemos aplicado cilindros de clonación para separar las distintas subpoblaciones, que son colonias formadas por una sola célula. <ol><li> Células de la placa a unos 50 ~ 100 células por placa de 10 cm. Incubar en un 37 ° C y 5% de CO 2 incubadora de 1 a 2 semanas. Durante este período, examinar colonias bien aisladas con un microscopio invertido. Una vez que las colonias han alcanzado su tamaño lo suficientemente grande (mejor más de 100 células en cada colonia), marca las colonias con un rotulador en la parte inferior del plato. Al recoger la colonia a marcar, asegúrese de que no hay colonias cercanas a la recogió una. </li><li> Aspirar a medio y lavar el plato una vez con D-PBS 1X. Recoger un cilindro de clonación estéril con una pinza estéril y suavemente a cabo alrededor de la colonia marcados. Repite esto hasta que todas las colonias marcadas tiene un cilindro colocado sobre la clonación. Las colonias elegido debe estar lejos de cada uno de esos otros que todos los cilindros de clonación sólo contiene una colonia. </li><li> Agregar 100μl de tripsina-EDTA a cada cilindro clonación y poner el plato de nuevo a la incubadora de ~ 5 minutos. Después de 5 minutos, comprobar que las células bajo el microscopio para ver si son redondeo. Cuando las células se han levantado, para añadir la misma cantidad de medio de cultivo para inactivar la tripsina. Mezclar la suspensión celular con una micropipeta 200μl y la transferencia de la suspensión celular a un plato de 60 mm que contiene 3 ml medio de cultivo precalentado. Etiqueta de los platos correctamente y vuelva a colocarlas en la incubadora. El seguimiento de cambios morfológicos en los próximos días. </li></ol> 5. Resultados representante De acuerdo con el protocolo descrito en la parte de rata aislada MSC, MSC plástico adherente debe ser visible al día siguiente después de la siembra. Como las células continúan proliferando, las células confluentes se parecen a las células se muestra en la Figura 1. Cuando las células alcanzan ~ 80% de confluencia (fig. 1B), subcultivo puede llevarse a cabo. Durante la subcultura, la tripsina-EDTA se utiliza para separar las células y las células levantado son pequeños y redondos, como se muestra en la Figura 1C. <img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Imágenes de contraste de fase de las MSC de la rata. (A) confluentes MSC. La mayoría de las células son fusiformes o en forma de estrella. (B) MSC alrededor del 80% de confluencia. (C), las células se suprimió después de tripsina son pequeñas y redondas. Una vez que las MSCs son enriquecidos por la clasificación de células magnéticas, análisis de citometría de flujo se lleva a cabo para verificar las expresiones marcador de superficie. Si el enriquecimiento es bueno, las células que muestran una tinción positiva en contra de los marcadores CD54 y CD90 MSC, pero negativos contra el marcador CD45 HSC (Figura 2). Isotipo IgG2a e IgG1 controles se utilizaron como controles negativos. <img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Análisis de citometría de flujo de las MSC de marcadores de superficie. MSC fueron marcadas con anticuerpos contra IgG2a (control de isotipo 1), IgG1 (control de isotipo 2), CD45, CD54 y CD90. MSC expresaron CD54 y CD90, pero no CD45. Cuando las células se sembraron a una densidad adecuada clonal, las colonias deben aumentar a partir de células individuales. La figura 3A representa una colonia formada por una sola célula. Cilindros de clonación se puede utilizar para separar las colonias y las células derivadas de las colonias pueden ser cultivadas por separado. Figura 3B y 3C representa las células derivadas de dos colonias. Las células derivadas de la colonia de un eje, como son (Figura 3 B), mientras que las células derivadas de la colonia 2 son redondos (Figura 3C). <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. La formación de colonias de MSC y una sola colonia de células derivadas. CMM cultivadas en las colonias de clones individuales de la densidad de la forma. Estas colonias pueden ser separados por cilindros de clonación y células de diferentes colonias se pueden cultivar por separado. (A) Un representante de la colonia formada por MSC cuando se siembran a una densidad clonal. (B) del eje, como las células derivadas de una colonia. (C), las células derivadas de la Ronda de otra colonia.

<ol>
	<li>de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+glial+glutamate+transporters+in+adult+mesenchymal+stem+cells.">Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells.</a> J Neurochem. 91, 155-166 (2004).</li><li>Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+dexamethasone+withdrawal+on+osteoblastic+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells.">Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells.</a> J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).</li><li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+mesenchymal+stem+cells:+their+phenotype,+differentiation+capacity,+immunological+features,+and+potential+for+homing.">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).</li><li>Abdallah, B. M., Kassem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells:+from+basic+biology+to+clinical+applications.">Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications.</a> Gene Ther. 15, 109-116 (2008).</li><li>Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Krause+Plasticity+of+marrow-derived+stem+cells.">Krause Plasticity of marrow-derived stem cells.</a> Blood. 102, 3483-3493 (2003).</li><li>Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+subpopulation+of+rapidly+self-renewing+and+multipotential+adult+stem+cells+in+colonies+of+human+marrow+stromal+cells.">Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).</li></ol>

Este protocolo describe cómo aislar y enriquecer MSC. Un método para separar las células de una sola colonia de derivados también se ha incorporado. Hay varios pasos que son importantes para una separación exitosa de aislamiento, el enriquecimiento y la colonia. Mientras se hace el aislamiento de células de rata, se recomienda filtrar con un colador celular o una malla de nylon estéril de tamaño similar para deshacerse de los coágulos de sangre y restos óseos. Después de la siembra de las células durante la ...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1X D-PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14040-133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11885-084</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>352350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>26140-079</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen-Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25200-056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Imagnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>552311</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin mouse IgG2a</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>555572</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin mouse IgG1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>555747</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin anti-rat CD54</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cedarlane Labs</td>
<td>CL054B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin anti-rat CD90</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cedarlane Labs</td>
<td>CL005B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin anti-rat CD45</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cedarlane Labs</td>
<td>CL001B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Imag buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>552362</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Round-bottom tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>352063</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin particles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>557812</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SA-PE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D systems</td>
<td>F0040</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cloning cylinder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C2059</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and enrichment of rat mesenchymal stem cells (mscs) and separation of single-colony derived mscs

MSC son una población de células madre adultas, que es una fuente prometedora para aplicaciones terapéuticas. Estas células pueden ser aisladas de la médula ósea y pueden separarse fácilmente de las células madre hematopoyéticas (HSC), debido a su adhesión de plástico. Este protocolo describe cómo aislar las MSC del fémur y la tibia de ratas. Las células aisladas se enriquecieron aún más en contra de dos marcadores de superficie CD54 y CD90 MSC por la clasificación de células magnéticas. Expresión de marcadores de superficie CD54 y CD90 fueron luego confirmadas por análisis de citometría de flujo. HSC marcador CD45 también se incluyó para comprobar si los ordenados MSC se agotaron las CMH. MSC son, naturalmente, muy heterogéneos. Hay subpoblaciones de células que tienen diferentes formas, la proliferación y diferenciación de las capacidades. Estas subpoblaciones todos expresan el conocido marcadores de CMM y ningún marcador único ha sido identificado por las distintas subpoblaciones. Por lo tanto, un enfoque alternativo para separar las distintas subpoblaciones está utilizando cilindros de clonación para separar de una sola colonia de células derivadas. Las células derivadas de las colonias solo se puede cultivar y evaluar por separado.

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Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

Rata MSC fueron aisladas de fémur y la tibia y luego enriquecido por la clasificación de células magnéticas. Células seleccionadas fueron confirmados para la expresión de marcadores de superficie por citometría de flujo. Estas células fueron cultivadas a una densidad de clones para formar colonias aisladas y luego estas colonias fueron separados por cilindros de clonación.

Aislamiento y enriquecimiento de las células de rata madre mesenquimales (MSC) y la separación de una sola colonia Derivado MSC

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and ...

isolation-enrichment-rat-mesenchymal-stem-cells-mscs-separation

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

28.3K vistas.  City of Hope Cancer Center. Rata MSC fueron aisladas de fémur y la tibia y luego enriquecido por la clasificación de células magnéticas. Células seleccionadas fueron confirmados para la expresión de marcadores de superficie por citometría de flujo. Estas células fueron cultivadas a una densidad de clones para formar colonias aisladas y luego estas colonias fueron separados por cilindros de clonación.

Video: Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Aislamiento y trasplante de células madre hematopoyéticas (HSC)

Investigación

Biología

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

Aislamiento y suero animal expansión libre de cordón umbilical humano derivado de células mesenquimales del estroma (MSC) y endoteliales formadoras de colonias Células Progenitoras (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation &amp; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

Aislamiento y Caracterización de Hoechst Baja CD45 Negativo Mouse células madre mesenquimales de pulmón

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Aislamiento y cultivo primario de células hepáticas de ratas

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult stem cells from liposuctioned adipose tissue that they initially termed Processed Lipoaspirate Cells or PLA cells. Since then, these stem cells have been renamed as Adipose-derived Stem Cells or ASCs and have gone on to become one of the most popular adult stem cells populations in the fields of stem cell research and regenerative medicine. Thousands of articles now describe the use of ASCs in a variety of regenerative animal models, including bone regeneration, peripheral nerve repair and cardiovascular engineering. Recent articles have begun to describe the myriad of uses for ASCs in the clinic. The protocol shown in this article outlines the basic procedure for manually and enzymatically isolating ASCs from large amounts of lipoaspirates obtained from cosmetic procedures. This protocol can easily be scaled up or down to accommodate the volume of lipoaspirate and can be adapted to isolate ASCs from fat tissue obtained through abdominoplasties and other similar procedures.

In 2001, researchers at UCLA described the isolation of a population of adult stem cells, termed Adipose-derived Stem Cells or ASCs, from adipose tissue. This article outlines the isolation of ASCs from lipoaspirates using a manual, enzymatic digestion protocol using collagenase.

Aislamiento Manual de células madre derivadas de tejido adiposo de Lipoaspirates Humanos

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Aislamiento y cultivo de células madre epiteliales dental del adulto Ratón Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

Aislamiento de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Las células estromales mesenquimales de pulmón Residente de los pulmones de ratas

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) provide a consistent ex vivo cellular system that are functionally like that of in vivo adipocytes. Use of ADSCs in biomedical research allows for cellular investigation of adipose tissue metabolic regulation and function. ADSC differentiation is necessary for adequate adipocyte expansion, and suboptimal differentiation is a major mechanism of adipose dysfunction. Understanding changes in ADSC differentiation is crucial to understanding the development of metabolic dysfunction and disease. The protocols described in this manuscript, when followed, will yield mature adipocytes that can be used for several in vitro functional tests to assess ADSC metabolic function, including but not limited to assays measuring glucose uptake, lipolysis, lipogenesis, and secretion. Rhesus macaques (Macaca mulatta) are physiologically, anatomically, and evolutionarily similar to humans and as such, their tissues and cells have been used extensively in biomedical research and for development of treatments. Here, we describe ADSC isolation using fresh subcutaneous and omental adipose tissue obtained from 4&#8211;9-year old rhesus macaques. Adipose tissue samples are enzymatically digested in collagenase followed by filtration and centrifugation to isolate ADSCs from the stromal vascular fraction. Isolated ADSCs are proliferated in stromal media followed by approximately 14&#8211;21 days of differentiation using a cocktail of 0.5 &#956;g/mL dexamethasone, 0.5 mM isobutyl methylxanthine, and 50 &#956;M indomethacin in stromal media. Mature adipocytes are observed at approximately 14 days of differentiation. In this manuscript, we describe protocols for ADSC isolation, proliferation, and differentiation in vitro. Although, we have focused on ADSCs from rhesus macaque adipose tissue, these protocols can be utilized for adipose tissue obtained from other animals with minimal adjustments.

In this article, we describe isolation of rhesus macaque derived adipose-derived stem cells (ADSCs) using an enzymatic tissue digestion protocol. Next, we describe ADSC proliferation which includes cell detachment, counting and plating. Lastly, ADSC differentiation is described using specific adipogenic inducing agents. Additionally, we describe staining techniques to confirm differentiation.

Aislamiento, proliferación y diferenciación de células madre derivadas de tejido adiposo de macaco rhesus

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological regulators of organismal homeostasis and important indicators of pathologies; in the meantime, their immense potential to establish accessible and controllable disease therapeutics is emerging. Mesenchymal stem cells (MSCs) can release large amounts of EVs in culture, which have shown promise to jumpstart effective tissue regeneration and facilitate extensive therapeutic applications with good scalability and reproducibility. There is a growing demand for simple and effective protocols for collecting and applying MSC-EVs. Here, a detailed protocol is provided based on differential centrifugation to isolate and characterize representative EVs from cultured human MSCs, exosomes, and microvesicles for further applications. The adaptability of this method is shown for a series of downstream approaches, such as labeling, local transplantation, and systemic injection. The implementation of this procedure will address the need for simple and reliable MSC-EVs collection and application in translational research.

The present protocol describes the differential centrifugation for isolating and characterizing representative EVs (exosomes and microvesicles) from cultured human MSCs. Further applications of these EVs are also explained in this article.

Aislamiento, caracterización y aplicación terapéutica de vesículas extracelulares a partir de células madre mesenquimales humanas cultivadas

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...