El objetivo general de este protocolo es aislar y caracterizar el tejido adiposo rojo, las células madre mesenquimales secas y diferenciarlas hacia las células productoras de insulina utilizando métodos simples. Las células madre mesenquimales han encontrado los caminos en el campo de la genética. Se pueden aislar de diversas fuentes, como la médula ósea, el tejido adiposo y el tejido perinatal.
Aceptan excelentes características culturales. Son multi potentes y potencialmente pueden tratar diversas enfermedades. El tejido adiposo proporciona una rica fuente de células madre mesenquimales.
Estas MSC adiposas se pueden aislar de lipoaspirados fácilmente con alto rendimiento en comparación con otras fuentes como la médula ósea. Y pueden proporcionar una buena fuente para el trasplante autólogo y alogénico. En este vídeo se presenta un protocolo sencillo para el aislamiento y caracterización de células madre mesenquimales adiposas a partir de grasa epidídima de rata.
Este procedimiento es un método simple y altamente eficiente para el aislamiento. Después del aislamiento, soportaremos la diferenciación de estas células madre mesenquimales adiposas en células productoras de insulina utilizando un protocolo simple y relativamente corto. Comenzaremos con el aislamiento de las células madre mesenquimales adiposas por digestión colágena de la grasa epidídima para obtener una fracción vascular más fuerte.
Luego, las células madre mesenquimales se caracterizarán por su adherencia plástica, así como la expresión de marcadores de CD y la diferenciación en múltiples linajes mesodérmicos. Anestesiar al animal, luego sacrificar mediante luxación cervical. Rocíe todo el cuerpo con etanol al 70% y comience con la escisión de la piel y los músculos en la parte inferior del abdomen.
Luego exponga los testículos con la grasa epidídima. Corte suavemente la grasa del epidídimo. Tenga cuidado de no cortar los vasos sanguíneos con las grasas.
En un gabinete de bioseguridad, corte el tejido graso en trozos pequeños con fórceps y bisturí. Transfiera el tejido adiposo al tubo centrífugo que contiene PBS estéril de 10 mililitros. Comience a lavar inclinando el tubo Falcon durante 45 segundos.
Luego mantenga el tubo de pie durante cinco minutos para separarlo en dos capas. Retire el PBS infranado con una jeringa de 10 mililitros. Repita estos pasos de lavado de cuatro a cinco veces hasta que PBS esté claro.
Después del lavado, vuelva a suspender el tejido adiposo en solución colágena, luego incube en un baño de agua agitada hasta que el tejido esté casi homogéneo. Después, vórtice la mezcla de colágeno tisular durante 15 segundos, luego centrífuga durante cinco minutos. Después de la centrifugación, tendrá tres capas.
Deseche cuidadosamente el sobrenadante sobre la fracción vascular del estroma. Primero deseche la capa de aceite en la parte superior con cuidado, seguido de la capa de ecos sin perturbar la bolita de fracción vascular estromal. Vuelva a suspender la fracción vascular estromal en BSA estéril y vuelva a centrifugar durante cinco minutos.
Centrifugación completa, coloque el medio DMEM F-12 completo en matraz cuadrado de 25 centímetros. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo vascular estromal en medios DMEM F-12 completos. Y traslado al matraz de cultura.
Coloque en la incubadora de dióxido de carbono de 37 grados 5%. Al día siguiente, retire las celdas no unidas y reemplace los medios con medios nuevos. A partir del siguiente día de aislamiento, las células similares a los fibroblastos comenzarán a aparecer.
Luego, gradualmente, a medida que pasa el tiempo, aumentarán en número y tamaño. Al pasar, las células se volverán más homogéneas. Estas células exhiben todos los criterios de caracterización de células madre mesenquimales.
Estas células se diferenciaron hacia células productoras de insulina utilizando este protocolo simple que contiene nicotinamida beta mercaptoetanol y Exendin-4. A lo largo de los pasos de diferenciación, las células comienzan a perder su forma fibroblástica y creo que se agrupan como la morfología. Cuando se usan células productoras de insulina muestran una tinción positiva de distionona roja carmesí, luego las células productoras de insulina utilizadas expresan varios marcadores de células beta como Pdx-1, mafA e insulina.
Además, las células productoras de insulina inducidas secretan niveles más altos de insulina en el sobrenadante cuando se les desafía con una mayor concentración de glucosa. Proporcionamos un protocolo detallado y gradual para el aislamiento y la caracterización de las células madre mesenquimales adiposas. También proporcionamos aquí un protocolo relativamente corto, simple y eficiente para la diferenciación de células madre mesenquimales adiposas en células productoras de insulina.
Esto proporciona una puerta de entrada para que el investigador ingrese al campo de las células madre mesenquimales y estudie su diferenciación en células productoras de insulina.
