Este trabajo fue financiado por becas de SMM: AHA GIA0855953G, NIH 1R01 HL091105-01. El apoyo adicional fue proporcionada por: DW: NIH RO1DK075013, DDK y la Fundación Kleberg, el núcleo de Citometría de Flujo UCCC (NIH 5 P30 CA 46934-15), el núcleo UCCC Microarray (NCI P30 CA 46934-14).

1. Aislamiento de pulmón <ol><li> Sacrificio de los ratones adultos (8-10 semanas de edad, 18 a 20 g; C57Bl6J) los ratones con una sobredosis de isoflurano seguido por exanguinación mediante una técnica estéril. Perfiles pueden variar ligeramente entre las cepas. </li><li> Extraer quirúrgicamente el diafragma, abrir la cavidad torácica por el corte de la caja torácica lateralmente a cada lado del ratón. Lavar la sangre de los pulmones por perfusión del ventrículo derecho del corazón con cuidado usando 3-5ml de tampón fosfato salino (PBS). </li><li> Diseccionar los lóbulos pulmonares de retirar la tráquea, los bronquios grandes y colocar en una placa de Petri llena de solución salina tamponada Hanks (HBSS). Tras la recolección de todos los lóbulos pulmonares con fórceps se utilizan para colocar el tejido en la tapa del plato. El tejido se picada en trozos pequeños con bisturí desechable, con suficiente líquido para mantener la humedad, pero no tanto que flotan y se mueven. </li><li> La disección de un miembro posterior de uno de los ratones y aislar la médula ósea para su uso como un control de tinción para establecer la flow citometría de puertas. Mancha de la médula ósea (MO) como se describió anteriormente 1. </li></ol> 2. Preparación de una suspensión de células individuales del tejido pulmonar <ol><li> Cada pulmón se digiere con un peso del tejido optimizado en relación al volumen de 0,2 g: 5ml de pre-calentado 0,2% Worthington tipo 2 colagenasa (Worthington Bioquímicos, Lakewood, NJ, cat # LS004202) disuelto en HBSS estéril. La mezcla se sumerge en un baño de agua 37 ° C durante 30 min 2,3. </li><li> Triturar la muestra bien hasta que digerir el tejido pulmonar fluye fácilmente a través de una pipeta de 10 ml (aproximadamente 10 repeticiones). Incubar durante otros 15 minutos a 37 ° C para completar el tejido digiere y se asegura una suspensión de células individuales más uniforme. </li><li> Diluir la suspensión de células de pulmón con HBSS y triturar con una pipeta de 5 ml para dispersar fragmentos residuales del tejido. </li><li> Filtrar la suspensión utilizando un colador para eliminar células 70μM fragmentos sin digerir el tejido. Muestra se puede dividir en multipltubos cónicos e en este punto para evitar la sobrecarga de un colador celular y disminuir el tiempo. </li><li> Pellet la suspensión celular durante 10 minutos a 1500 rpm y se decanta el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento celular suavemente con la temperatura ambiente RBC tampón de lisis (eBiosciences, San Diego, CA, cat # 00-4333-57) e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir un volumen igual de HBSS para desactivar el buffer de lisis y el filtro de la suspensión celular de células utilizando un colador para eliminar los restos 40μM y agregados de células. </li><li> Pipeta 10μl de cada muestra que se tiñen y contar el número de células, tanto para el pulmón y muestras BM utilizando un hemocitómetro. Nota: El registro del volumen total de las células. </li><li> Pellet la suspensión de células individuales de las células del pulmón por centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos. </li><li> Resuspender los pulmones y las células BM en 1x10 6 células / ml en precalentado (37 ° C) + DMEM (Dulbecco modificado de Eagle medio, alto nivel de glucosa (Gibco, Carlsbad, CA, cat # 11965-092) que contiene 2% fetal BOVIne suero (FBS) y HEPES 10 mM. </li><li> Preparar una solución de 1mg/ml de colorante Hoechst 33342 (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, cat # B2261) en el agua y el filtro de esterilización de 1,4. El colorante Hoechst se puede almacenar en alícuotas a -80 ° C. </li><li> Agregar colorante Hoescht 33342 a una concentración final de 5μg/ml (una dilución de 200 veces de un depósito 1mg/ml) a la suspensión de células individuales. </li><li> Mezclar suavemente las células por la inversión e incubar a 37 ° C baño de agua durante exactamente 90 minutos. </li></ol> 3. Tinción y preparación de la suspensión de pulmón de células para el análisis de citometría de flujo <ol><li> Después de 90 minutos todas las medidas con las células del pulmón Hoechst manchadas deben ser ejecutados a 4 ° C o en hielo para evitar flujo de salida de medio de contraste. Que sedimenten las células por centrifugación a 1500 rpm durante 10 min a 4 ° C y se resuspenden las células en helado tinción de amortiguación (PBS 2% de SFB). </li><li> Resuspender las células a una concentración de no más de 1x10 7 células / tubo con 300-600μl de PBS que contenía 2%FBS y HEPES 10 mM. </li><li> Añadir adecuadamente risita anticuerpos CD45 (por lo general la dilución 1:200 de CD45-APC (BD Pharmingen, San Diego, CA, cat # 559864) en el pulmón y las muestras BM Incubar en hielo durante 10-15 minutos Incluye un control sin manchas durante la.. procedimiento experimental es útil para establecer el análisis de las puertas. </li><li> Precipitar las células a 4 ° C por 5 min a 1500 rpm. Decantar el sobrenadante y resuspender las células en 500 l de tampón de tinción refrigerados (PBS 2% de SFB). Transferencia a los tubos enfriados previamente snap de polipropileno tapa (Fisherbrand, Schaumburg, IL, cat # 14-956-1D). </li><li> Añadir yoduro de propidio (PI, las acciones de 200μg/ml en PBS) a las muestras para una concentración final de 2μg/ml para excluir las células muertas. PI debe ser utilizado en combinación con el colorante Hoechst 33342 para lograr el perfil correcto de fluorescencia en el análisis de citometría de flujo. </li><li> Tubos de tienda en el hielo, protegido de la luz hasta el análisis de citometría de flujo. </li></ol> 4. El análisis de citometría de flujo para definir y aislarun pulmón de células madre mesenquimales (MSC pulmón) Población que utiliza el reactivo de Hoechst Eflujo para detectar un lado la población (SP) <ol><li> Este ensayo tiene los requisitos siguientes instrumentos: </li><ul><li> 488 nm y láser UV (350 a 355 nm) </li><li> 2 detectores en el camino láser UV de color azul (450/65) y filtros de color rojo (675/50). </li><li> El detector de color rojo UV debe tener una alta sensibilidad para la luz roja. Esto puede ser un problema con los clasificadores celulares viejos. </li><li> Chiller para mantener la unidad de la muestra a 50-10 º C. </li></ul><li> Alinear los láseres y preparado para la selección de células siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> Recoger la roja (eje x) y azul (eje Y) las señales de Hoechst utilizando una escala lineal. </li><li> Ajustar los voltajes de tubo fotomultiplicador colocar el pico G0/G1 en la parte superior derecha del centro de la parcela para permitir la visualización adecuada de la población hemisferio posterior. Una parte de la fase S y todo el G2 del ciclo celular puede ser fuera de escala en la parte superior derecha de la trama. El SIG azulnal es relativamente brillante, mientras que la señal roja es tenue. Típica XDP MoFlo (Beckman Coulter, Miami, FL) voltajes son 425 para el azul y 650 para el rojo. </li><li> Las células muertas son cerradas a cabo con PI. La norma camino PI (excitación 488 nm, emisión 630 nm) pueden ser utilizados. Por otra parte, PI también está entusiasmado por el láser UV y la población de células muertas se encuentra fuera de escala en el lado derecho de la población lateral (SP) trama. Esto alivia la necesidad de compensar la señal IP de cualquier otra fluorocromos como el FITC y PE. El método original de Goodell seguido los procedimientos de este último 5-7. </li><li> Mantener un diferencial de presión relativamente baja durante el análisis y la clasificación para asegurar la resolución ajustada de la población de lado. </li><li> El SP se presenta como un brazo lateral, aparte de la principal población de células de los pulmones. Esta población se denomina Hoechst baja. </li><li> La baja Hoechst / SP se analiza para separar las poblaciones CD45 positivos y negativos utilizando un histograma 2,3 (Figura 1). </li><li> Después de la selección y la compuerta de la Hoechst baja CD45 neg población MSC pulmón, las células pueden ser recogidos por la clasificación, ya sea como una población mixta en un tubo o de un solo aislar clones en una placa de 96 pocillos 3. </li><li> Para la placa de clasificación de la desviación tipo corriente se ajusta al 25% para crear una corriente de tipo más vertical que suele utilizar para la clasificación del tubo. </li><li> El objetivo de la corriente de clase mediante el envío de un pulso de corriente de prueba en la parte superior izquierda y luego la parte inferior derecha de una placa de 96 pocillos. </li><li> Configure el software clasificador de mapa de la placa para depositar la cantidad deseada de células en cada pocillo. </li><li> Para aislar clones de células individuales un MSC solo pulmón se clasifica en el pozo de una placa de 96 pocillos en 150μl de la cultura de los medios de comunicación (α-MEM suplementado con FBS al 20%). Después de la clase un 100μl de medio adicional se agrega. </li></ol> 5. Aislamiento, cultivo y caracterización de los pulmones y el MSC Clones <ol><li> Culture y la expansión de la población mixta MSC pulmón y clones de células individuales siguiente clasificación es idéntica con las condiciones de cultivo estándar (37 ° C, 5% de CO 2 y humedad&gt; 95%). Las células se permite que se adhieran aislamiento después de 16 horas. Los medios de comunicación se reemplaza cada 48 horas (α-MEM suplementado con FBS al 20%). Cuando las células empiezan a proliferar más rápidamente y llegar a la confluencia entre el 75-80% que se pasan (Figura 2). </li><li> Las células se lavan con HBSS precalentado y se incubaron con tripsina al 0,5% / EDTA (Cellgro, Manassas, VA, cat # 25-053-Cl) a 37 ° C durante menos de 2 min. Las células se determinan con un alcance invertido para confirmar la aparición de una suspensión celular. </li><li> MSC pulmón se dividen en proporciones de 1:2 o 1:3 dependiendo de la tasa de proliferación actual de la cultura. </li><li> La capacidad de las MSC de pulmón de diferenciarse en linajes mesenquimales tradicionales de los osteoblastos, adipocitos y condrocitos y su expresión en la superficie de células de aceptada marcadores mesenquimales is evaluados para cada preparación de células. El análisis citogenético de bandas también se realiza para confirmar la ausencia de graves anomalías cromosómicas 2,3,8-11. </li></ol> 6. La enumeración de MSC pulmón mediante un ensayo de formadoras de colonias (CFU-F) <ol><li> Diluir las células en un medio de MesenCult completo (Tecnologías de Células Madre, Vancouver, BC) a una concentración final de 1x10 6 células / ml. </li><li> Realizar diluciones en serie para alcanzar las concentraciones finales en un plato de 100 mm de 6x10 4 células, 3x10 4 células, 1,5 x10 4 células y 0,75 x10 4 células en 10 ml de los medios de comunicación. Los análisis se realizaron por triplicado o duplicado para cada concentración de células y puede ser escalado para superficies pequeñas. </li><li> Células en cultivo durante 10 días en condiciones normales. El día 10 las células se lavan con PBS y fijadas con metanol al 100% durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Detectar la CFU-F colonias mediante la tinción con w / v 0.4% de solución de Giemsa(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) diluido 1:20 con agua desionizada. Permita que las muestras se sequen al aire y cuantificar el número de colonias que contenga más de 25 células por colonia (Figura 3). </li></ol> 7. Análisis de las propiedades inmunomoduladoras de MSC pulmón en células T-proliferación y la apoptosis <ol><li> 6.25x10 4 células de pulmón por MSC y se sembraron en placas de 96 pocillos y se deja reposar durante la noche 2. </li><li> Las células CD4 + a partir de bazos de receptor de células T (TCR) de ratones transgénicos, OT-II con las células T que reconocen el péptido 323-339 ovoalbúmina, son purificadas por el agotamiento de CD8 +, CD19 +, MHC-II + y CD25 + en las células con un clasificador de células Miltenyi AutoMACS (Miltenyi, Auburn, CA). Células presentadoras de antígeno (APC) se encuentran aisladas por la clasificación positiva de MHC-II + en las células 12. </li><li> APC se fija en el 4% de paraformaldehído, se lavaron 3 veces en PBS / EDTA al 5% BSA/2mM, y cargado con 0.5μg/ml o 5μg / ml OVA323 péptido. </li><li> Crecimiento simulado, arrestado APC se añaden a la MSC de pulmón en placas de 96 pocillos. </li><li> Más del 95% de CD4 + puro 1x10 5 células se marcan con 5μM carboxifluoresceína succinimidil ester (CFSE, Sigma, St. Louis MO) en PBS y se incubó durante 5 min en la oscuridad, se lava con PBS-BSA al 5%, y añade a la APC y las células del pulmón MSC en DMEM 5% de SFB medios de comunicación. Células se incubaron durante 96 horas. </li><li> T-células se tiñeron con anti anti-CD40 (Cy5), CD4 (APC-Cy7), CD8 (ViolBlue); vbeta 5 (PE) y se analizaron utilizando un Miltenyi MacsQuant 7 citómetro de flujo del canal (Miltenyi, Aurburn, CA) y Flojo el análisis de software (Treestar, Ashland, Oregón). Proliferación se mide como la disminución de la intensidad media de fluorescencia de CFSE en comparación con el fondo, las células T marcadas con CFSE y no expuestos a la APC (Figura 4). Las células T se cuentan en este momento y de viabilidad determinado con exclusión del azul tripano. </li></ol> 8. Los resultados representativos: Figura 1. Citometría de flujo análisis y definición de MSC pulmón. Suspensiones de células individuales de digerir el tejido pulmonar se tiñeron con Hoechst 33342 y analizadas por citometría de flujo para detectar diferencias en una. dispersión frontal (FSC) y la dispersión lateral (SSC) y B. Hoechst azul y fluorescencia de color rojo. La presencia de un lado la población (SP) es visible en la puerta. La Hoechst baja SP se analiza para separar el C. CD45 negativas de la población de MSC pulmón. El CD45 positivo a las relaciones negativas de pulmón SP son típicamente 70:30 / 60:40. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Aislamiento y cultivo de MSC pulmón. Tras la recogida de la MSC de pulmón por la clasificación de células, las células son colocadas en cajas de 30 mm con α-MEM supplemented con FBS al 20%. A. Las células recién ordenados parecen pequeños, redondos y brillantes. B. Después de aproximadamente 2-3 semanas, con colonias de un fenotipo mesenquimatoso, se hacen evidentes y la proliferación es más evidente. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Enumeración de MSC por Formadoras de Colonias-fibroblastos de ensayo. Ampliado de pulmón MSC son colocadas por el protocolo descrito para el ensayo de CFU-F. A. Después de 10 días y las colonias Giemsa son evidentes. Colonias B. son grandes y están compuesto por un unos pocos cientos de células. C. Las células presentan un fenotipo mesenquimal. A &amp; B, barra de escala = 0,5 cm, barra de escala C = 0,14 cm. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. CFSE células T basada Ensayo de proliferación. En ausencia de MSC pulmonar y la presencia de antigen las células presentadoras (APC) + / - ovoalbúmina (OVA) CD40 células T efectoras positivas demuestran una disminución en la intensidad de la CFSE que indica la proliferación (círculo rojo). La intensidad de fluorescencia CFSE de la membrana de las células T disminuye con cada estequiométricamente es decir, la división celular. con todas las divisiones. En la presencia de cáncer de pulmón MSC, APC + / - OVA, CD40 de células T efectoras positivas demuestran ningún cambio significativo en la intensidad de la CFSE que indica una falta de proliferación (círculo rojo).

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	<li>Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).</li><li>Jun, D. 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No hay conflictos de interés declarado.

Hemos adaptado un método inicialmente usado para identificar BM células hematopoyéticas para aislar a una población específica de MSC pulmón residente. Debido a la reproducibilidad de aislamiento de estas células fueron entonces bien caracterizados como MSC. Su origen se ha definido como residente en el pulmón de ratones adultos (a diferencia de BM derivados) y un perfil fenotípico y molecular documentado 2. La capacidad de aislar repetidamente esta población caracterizada permite el estudio más de la importancia biológica y el papel del MSC de pulmón durante la homeostasis del tejido y la enfermedad. La reciente definición de esta población en vivo en el tejido pulmonar, tanto murinos y humanos facilita el desarrollo de una estrategia terapéutica dirigida a rescatar a las células endógenas para facilitar la reparación de pulmón durante la lesión y la enfermedad.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Tampón fosfato salino (PBS) </td><td> Sigma </td><td> P-5368 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks solución salina tamponada (HBSS) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30588.01 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,2% Worthington tipo 2 colagenasa </td><td> Worthington Bioquímicos </td><td> LS004202 </td><td></td
></tr><tr><td> Glóbulos rojos tampón de lisis </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td></td
></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> 11965-092 </td><td></td
></tr><tr><td> Colorante Hoechst 33342 </td><td> Sigma </td><td> B2261 </td><td></td
></tr><tr><td> CD45-APC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559864 </td><td></td
></tr><tr><td> Yoduro de propidio </td><td> Sigma </td><td> 81845 </td><td></td
></tr><tr><td> a-MEM </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30265.01 </td><td>; </td
></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-069 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,5% de tripsina / EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25-053-Cl </td><td></td
></tr><tr><td> Media MesenCult completa </td><td> Madre Cell Technologies </td><td> 05511 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,4% w / v solución de tinción Giemsa </td><td> Sigma </td><td> GS1L </td><td></td
></tr><tr><td> Paraformaldehído al 4% </td><td> Electron Microscopy Servicios </td><td> 15710 </td><td> 16% paraformeldehyde se diluye al 4% con PBS </td
></tr><tr><td> Carboxifluoresceína succinimidil ester (CFSE) </td><td> Sigma </td><td> 21888 </td><td></td
></tr></tbody></table>

isolation &#38; characterization of hoechstlow cd45negative mouse lung mesenchymal stem cells

Las células madre mesenquimales de tejido residente (MSC) son importantes reguladores de la reparación de tejidos o la regeneración, fibrosis, inflamación de la angiogénesis y la formación de tumores. En conjunto, estos estudios sugieren que el MSC pulmón residentes juegan un papel en la homeostasis del tejido pulmonar, lesión y reparación en enfermedades como la fibrosis pulmonar (PF) y la hipertensión arterial (PAH). Aquí se describe una tecnología para definir una población de MSC pulmón residente. La definición de esta población en el tejido pulmonar in vivo utilizando un conjunto de marcadores definir facilita el aislamiento repetido de una población de células madre bien caracterizada por citometría de flujo y el estudio de un tipo específico de célula y la función.

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Isolation &amp; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

En este artículo se demuestra el aislamiento de las células del pulmón murino residentes madre mesenquimales (MSC pulmón), su expansión, la caracterización y análisis de las propiedades inmunomoduladoras.

Aislamiento y Caracterización de Hoechst Baja CD45 Negativo Mouse células madre mesenquimales de pulmón

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

isolation-characterization-hoechstlow-cd45negative-mouse-lung

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

20.3K vistas.  University of Colorado Denver. En este artículo se demuestra el aislamiento de las células del pulmón murino residentes madre mesenquimales (MSC pulmón), su expansión, la caracterización y análisis de las propiedades inmunomoduladoras.

Video: Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

Aislamiento y suero animal expansión libre de cordón umbilical humano derivado de células mesenquimales del estroma (MSC) y endoteliales formadoras de colonias Células Progenitoras (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Investigación

Biología

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

El aislamiento y la derivación de células embrionarias de ratón Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Aislamiento de células de la glándula salival del ratón madre

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Aislamiento y cultivo de células madre epiteliales dental del adulto Ratón Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

Aislamiento de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Las células estromales mesenquimales de pulmón Residente de los pulmones de ratas

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-interno celular masiva inyección de células madre embrionarias conduce a mayores tasas de quimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). Therefore, assessing mitochondrial function in primary TECs may provide valuable insight into the bioenergetic status of the cells, providing insight into the pathophysiology of CKD. While there are a number of complex protocols available for the isolation and purification of proximal tubules in different species, the field lacks a cost-effective method optimized for&#160;tubular cell isolation without the need for purification. Here, we provide an isolation protocol that allows for studies focusing on both primary mouse proximal and distal renal TECs. In addition to cost-effective reagents and minimal animal procedures required in this protocol, the isolated cells maintain high energy levels after isolation and can be sub-cultured up to four&#160;passages, allowing for continuous studies. Furthermore, using a high throughput extracellular flux analyzer, we assess the mitochondrial respiration directly in the isolated TECs in a 96-well plate for which we provide recommendations for the optimization of cell density and compound concentration. These observations suggest that this protocol can be used for renal tubular ex vivo studies with a consistent, well-standardized production of renal TECs. This protocol may have broader future applications to study mitochondrial dysfunction associated with renal disorders for drug discovery or drug characterization purposes.

This protocol provides a cost-effective approach to isolate and characterize mouse primary renal tubular cells that can subsequently be sub-cultured to assess renal biological functions ex vivo, including mitochondrial bioenergetics.

Aislamiento, caracterización y alto rendimiento análisis de flujo extracelular de ratón células epiteliales tubulares renales primarias

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

Aislamiento, caracterización y diferenciación de células cardiacas desde el corazón de ratón adulto

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...