El trabajo en el laboratorio de Montgomery sobre las respuestas de fitocromo en las plantas es apoyada por la National Science Foundation (subvención no. MCB-0919100 de BLM) y Ciencias Químicas, Geociencias y Ciencias Biológicas de la División de la Oficina de Ciencias Básicas de Energía, Oficina de Ciencia, EE.UU. Departamento de Energía (concesión no. FG02 DE 91ER20021 a BLM). Damos las gracias a Melissa Whitaker para la asistencia técnica durante el rodaje y la lectura crítica del manuscrito, Stephanie Costigan de asistencia experimental, el Dr. Luis Rey de asistencia con el desarrollo y la optimización de fluorescencia de células activadas clasificación protocolos para la clasificación de protoplastos de Arabidopsis y Marco Dra. Melinda ayuda con confocal microscopía. Damos las gracias a Marlene Cameron para asistencia en el diseño gráfico y de aves Karen por su asistencia editorial.

1. Crecimiento de las Plantas <ol><li> Confirmó UAS-GAL4 BVR X-GFP línea de trampas potenciador aislado como se describe 4 (Para un resumen ver fig. 1) y las líneas de tipo salvaje o de los padres se siembran en el suelo, es decir, ~ 2000 semillas esterilizadas por línea. </li><li> Las plantas son cultivadas durante 5 semanas en el suelo bajo una iluminación blanca de 100 μmolm -2 s -1 a 22 ° C y 70% de humedad. </li></ol> 2. Hoja de aislamiento de protoplastos (adaptado de Denecke Vitale y 9) <ol><li> Para aislar protoplastos, preparar TEX buffer. Para 1 litro de amortiguación TEX, pese a cabo los siguientes componentes: 3,1 g Gamborg de sales B5, 0,5 g de 2 - (N-morfolino) etanosulfónico (MES, 2,56 mM), 0,75 cloruro de calcio dihidrato (CaCl 2 .2 H 2 O, 6.75 mM), 0,25 g de nitrato de amonio (NH 4 NO 3, 3,12 mM), 136,9 g de sacarosa (0,4 M). Disolver los componentes por completo en ~ 900 ml de agua desionizada, destilada (DDC 2 O) y llevar el pH a 5.7 ​​con 1 M KOH. Alcanzar un volumen final de 1 litro y esterilizar con un filtro de 0,2 micras tapa de la botella-filtro conectado a una bomba de vacío. </li><li> Recoger las hojas verdes y saludables de las plantas (~ 250 ml de hojas muy apretadas en un vaso de precipitados) y enjuague con ~ 40 ml ddH2O 4 veces, seguido de lavado dos veces con agua estéril ddH 2 O. El uso de un bisturí # 20, las hojas cortadas en tiras finas y dividir el tejido en partes iguales en dos tubos de 50 ml de plástico estéril. Prepare 1x mezcla de digestión de la hoja mediante la adición de 5 ml de alícuota de solución madre 10 veces la hoja de la digestión (digestión 10x hoja de solución de reserva: disolver 2% w / v Macerozyme R-10, 4% w / v celulasa &quot;Onozuka&quot; R-10 en TEX buffer, filtro de esterilización con filtro de 0,2 micras y la congelación de alícuotas de 5 ml a -80 ° C) y 45 ml de tampón fresco TEX. Añadir ~ 25 ml de la mezcla de digestión 1x hoja por cada 50 ml tubo para cubrir todo el tejido de la hoja. </li><li> Vacío infiltrado en el tejido de la hoja en la mezcla de digestión en tubos abiertos durante 1 hora a temperatura ambiente usando un secador de vacío conectado a una bomba de agua, seguida por 3 horas de incubación a temperatura ambiente en un eje de balancín con agitación suave. Tubos tapados con tejido de la hoja en la mezcla de digestión 1x hoja se mantienen envueltas en papel de aluminio durante el proceso para prevenir la exposición a la luz. </li><li> Después de 3 horas, aumentar la velocidad del eje de balancín de ~ 2 minutos para liberar protoplastos. Filtrar la suspensión de protoplastos crudo a través de dos capas de gasa estéril para eliminar los residuos y recoger el filtrado en un vaso de vidrio estéril. Filtrar el filtrado a través de una malla de nylon de 100 micras estéril en una placa de Petri estéril. Recoge el flujo a través y la transferencia a un nuevo tubo estéril de 50 ml. El uso de 15-20 ml de tampón fresco TEX para lavar la placa de Petri estéril y recoger los protoplastos de adherirse a la superficie. </li><li> Centrífuga del flujo mediante el uso de un rotor basculantes en 100xg a 10 ° C durante 15 minutos (6 de aceleración, desaceleración 0). </li><li> Quitar ~ 25 - 30 ml del líquido por debajo de la capa de protoplasma flotante, que contiene los desechos residuales y pellets, con una estéril 9 &quot;pipeta Pasteur de vidrio conectado a una bomba peristáltica sin remover la capa flotante de protoplastos y dejando a ~ 10 a 15 ml de volumen. </li><li> Añadir nuevo buffer TEX a un volumen final de 40 ml, mientras que suavemente resuspensión de los protoplastos. </li><li> Repita los pasos 2,5 a 2,7 dos veces para eliminar los desechos celulares tanto como sea posible. El tiempo de centrifugación se reduce a 10 minutos de la primera repetición y a 5 minutos en la repetición final. </li><li> Aspirar protoplastos flotante con un corte, una pipeta de transferencia estéril ml en un tubo de 15 ml nuevos. Proceder directamente a su clasificación o almacenamiento en la oscuridad durante un máximo de 2 horas a 4 ° C hasta su ordenación. </li></ol> 3. Protoplastos clasificación por la selección de células activadas por fluorescencia (FACS) <ol><li> Antes de ordenar, analizar protoplastos por microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) utilizando un láser de 488 nm para la excitación para confirmar la integridad de protoplastos y la presencia de la fluorescencia de GFP en la piscina de protoplastos. Los residuos es necesario un mínimo para evitar la obstrucción de la boquilla de clasificación FACS. </li><li> Ordenar aislado protoplastos en TEX buffer mediante FACS (BD FACSVantage SE, BD Biosciences) utilizando una boquilla de 200 micras en una cabeza de tipo macro en las tasas de eventos entre 6.000 y 15.000, con un sistema de presión de alrededor de 9 psi a raíz de un protocolo de adaptación 10. </li><li> De tipo salvaje GFP no protoplastos se utilizan para determinar los umbrales de autofluorescencia. </li><li> Para recoger las buenas prácticas agrarias-positivas protoplastos, células usando un tipo refrigerado por aire con láser de argón (Spectra Physics modelo 177, Newport Corporation, Irvine, CA), operado a 100 mW en una línea de 488-nm argón para identificar la fluorescencia de GFP con una banda 530/30 filtro de paso. </li><li> Tras la recogida de GFP-positivas protoplastos, examinar protoplastos ordenados por CLSM como se detalla en el paso 3.1. </li><li> Extraer el ARN total a partir de protoplastos ordenados mediante un Qiagen RNeasy Plant Mini Kit. cDNA se puede preparar para la hibridación como se describe en Affymetrix GeneChip Expresión Manual de Análisis Técnico y luego hibridizado a ATH1 Arabidopsis arrays Affymetrix todo el genoma. </li></ol> Resultados representante Se detectó un número significativo de las buenas prácticas agrarias de células positivas en el canal de GFP por FACS (Fig. 2). En los ensayos de optimización de uso de las buenas prácticas agrarias potenciador trampa de los padres, la línea constitutivamente expresan GFP, J0571, muestra ~ 17% a 24% positivas GFP-protoplastos, mientras que la línea con la expresión vascular y cutánea, J1071, había ~ 1,4% GFP-positivas protoplastos (Tabla 1). Clasificación de 3 x 500 l (alrededor de 1,5 ml de la suspensión total de protoplastos) de J0571 protoplastos durante 1 hora dio ~ 100.000 GFP-positivas protoplastos. Clasificación de 3 x 500 l (alrededor de 1,5 ml de suspensión de protoplastos total) de J1071 protoplastos durante 1,5 horas dieron positivo ~ 3.000 GFP-protoplastos. Confocal de imágenes indica un rendimiento muy alto de protoplastos de ambas muestras J0571 J1071 y antes de la clasificación se llevó a cabo (Fig. 3C y 3E), y las fracciones contenidas ordenados única luz fluorescente GFP-protoplastos (Fig. 3G y datos no presentados). Este hallazgo confirma que intacta positivas GFP-protoplastos pueden ser ordenados a través de la FACS. Los protoplastos no las buenas prácticas agrarias también pueden ser ordenados y recogidos en un canal separado. Los protoplastos no GFP servir como un control ideal negativo para posteriores análisis de microarrays para detectar los cambios específicos en la expresión génica en la reducción de los niveles de holophytochrome. La extracción de RNA a partir de protoplastos aislados (1 ml) de ARN produce la cantidad suficiente para la detección de fluorospectrometry (Fig. 4). ARN aislado se evaluó mediante un instrumento NanoDrop (NanoDrop 1000, Thermo Scientific) y se cuantifica por NanoDrop 3.7.1 software de cuantificación del ARN. Los rendimientos de ARN a partir de pre-ordenados C24 de tipo salvaje protoplastos o FACS-ordenados, GFP-positivas protoplastos trampa potenciador superado el mínimo de 20 ng necesarios para su uso en el ARN de etiquetado para los ensayos de microarrays (Tabla 2). <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Potenciador trampa Línea </td><td> % De GFP-positivas protoplastos </td><td> Número de protoplastos GFP ordenados </td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 17,18% 24,06% ~ </td><td> 26400 ~ 36000 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> ~ 1,43% </td><td> 1000 ~ 1300 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Porcentaje de GFP-positivas protoplastos a partir de dos líneas de trampa potenciador antes de la clasificación y el número de GFP-positivas protoplastos recolectados mediante la ejecución de 500 l de suspensión de protoplastos a través del Clasificador de fluorescencia de células activadas (FACSVantage, BD). <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Planta de línea </td><td> ARN rendimiento (ng) </td></tr><tr><td> C24 PESO </td><td> 12,486.5 </td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> 71.5 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Rendimiento de aislamiento de ARN a partir de protoplastos. Se aisló el ARN de pre-ordenados C24 de tipo salvaje o ordenados GFP-positivas protoplastos a partir de dos líneas de trampa potenciador y cuantificados. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. GAL4 potenciador trampa basada en la inducción de la biliverdina reductasa (BVR) la expresión en plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana. (A). Un individuo seleccionado de una biblioteca de GAL4 basada en líneas de trampa potenciador, que contienen un gen GFP GAL4 sensible marcador, se puede cruzar con una línea que contiene un gen diana GAL4 sensible de inducir la expresión del gen diana en GAL4 que contienen las células marcadas por la fluorescencia de GFP. Sobre la base de una figura del Dr. Jim Haseloff (http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html). (B) Producción de fitocromo cromóforo, phytochromobilin (PΦB) y holophytochrome en las líneas parentales. (C) A la izquierda, la reducción de la biliverdina IXα (BV IXα) y PΦB por la biliverdina reductasa (BVR) la actividad de BR y PΦR, respectivamente. Resultados BVR actividad en el agotamiento de los PΦB y conduce a una reducción en la producción de fotoactivos holophytochrome. Derecha, la reacción catalizada por la BVR se muestra. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Fluorescencia clasificación de células activadas (FACS) representa la adquisición de puntos. Comparación de la célula de protoplastos de clasificación de C24 de tipo salvaje (A), J0571 (B) y J1071 (C). (A) Adquisición de diagrama de puntos de no-GFP fluorescentes C24 de tipo salvaje protoplastos excitado por un láser de 488 nm de argón y se utiliza para determinar el umbral de autofluorescencia. (B) y (C) representa la adquisición de puntos muestran las proporciones de los protoplastos de las buenas prácticas agrarias que son positivos en respuesta a la excitación de un láser de 488 nm. R3 puertas de la clasificación en B y C delimitar los objetivos de las buenas prácticas agrarias-positivas que fueron ordenados por clasificador de células activadas por fluorescencia (FACSVantage, BD) y se recoge. Canal rojo indica valores de autofluorescencia de clorofila a partir de protoplastos y el canal verde indica que los valores de la fluorescencia de GFP. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Microscopía confocal de protoplastos de plantas utilizadas para la clasificación de la célula. Láser confocal de imágenes escaneadas de protoplastos antes (A, C, E) y después (G) la clasificación a través de clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS). B, D, F y H son imágenes DIC. Protoplastos de C24 de tipo salvaje (A, B), J1071 (C, D) y J0571 (E, F, G, H) se muestran. Imágenes C, E y G se combinan imágenes de fluorescencia de GFP (BP 505 nm - 575 nm) y autofluorescencia (LP 650 nm) obtenidos a partir de la excitación con un láser de 488 nm. A través de H están en la media de 4 exploraciones de petróleo en 63x. Bar = 10 micras. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Cuantificación de ARN aislado a partir de protoplastos por fluorospectrometry. ARN extraído de (A) tipo C24 salvajes, (B) J0571, J1071 y (C). A indica ARN para la pre-ordenados de tipo salvaje protoplastos. B y C indican ARN de GFP-positivas protoplastos ordenados por la selección de células activadas por fluorescencia (FACS). Software de cuantificación del ARN, NanoDrop 3.7.1, (NanoDrop 1000, Thermo Scientific).

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Perfiles de expresión génica mediante microarrays (1) ha indicado que más del 30% de los genes en plantas de Arabidopsis se regula la luz 11 y (2) ha identificado un vasto grupo de genes que codifican proteínas de transducción de señales de luz que participan en la cascada de señalización fitocromo 12, 13 . Estos experimentos sugieren que la luz induce cambios rápidos y de largo plazo en la expresión génica. Cada grupo de fitocromos puede controlar sólo un subconjunto de respuestas de d...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Anti-BVR antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QED Bioscience Inc.</td>
<td>56257-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cellulase &#x201C;Onozuka&#x201D; R-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company</td>
<td>MSPC 0930</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gamborg&#x2019;s B5 basal salt mixture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Macerozyme R-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company</td>
<td>PTC 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MES, low moisture content</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M3671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Murashige and Skoog salts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caisson Laboratories</td>
<td>74904</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phytablend</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caisson Laboratories</td>
<td>28302</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNeasy Plant Minikit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>16419</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

investigating tissue- and organ-specific phytochrome responses using facs-assisted cell-type specific expression profiling in arabidopsis thaliana

Media luz una serie de procesos de desarrollo y de adaptación a través del ciclo de vida de una planta. Las plantas utilizan la luz que absorben las moléculas llamadas fotorreceptores para percibir y adaptarse a la luz. El rojo / rojo lejano que absorbe la luz fotorreceptores fitocromo se han estudiado ampliamente. Fitocromos existir como una familia de proteínas con diferentes funciones y la superposición de todos los sistemas de plantas superiores en las que se han estudiado<sup&gt; 1</sup&gt;. Fitocromo las respuestas mediadas por la luz, que van desde la germinación de las semillas a través de la floración y la senescencia, a menudo se localiza en los tejidos u órganos específicos de la planta<sup&gt; 2</sup&gt;. A pesar del descubrimiento y la elucidación de las funciones de fitocromo individual y redundante a través de análisis mutacional, informes concluyentes en sitios distintos de photoperception y los mecanismos moleculares de las piscinas localizadas de fitocromos espaciales que median las respuestas específicas fitocromo son limitados. Hemos diseñado experimentos basados ​​en la hipótesis de que los sitios específicos de photoperception fitocromo regula los tejidos y órganos específicos aspectos de fotomorfogénesis, y que las piscinas fitocromo localizada participar distintos subgrupos de genes blanco abajo en la señalización de célula a célula. Hemos desarrollado un enfoque bioquímico para reducir selectivamente fitocromos funcional de un órgano o tejido específico dentro de las plantas transgénicas. Nuestros estudios se basan en un potenciador del bipartito-trampa de enfoque que se traduce en la transactivación de la expresión de un gen bajo el control de la secuencia ascendente de activación (UAS) por el elemento activador transcripcional GAL4<sup&gt; 3</sup&gt;. La biliverdina reductasa (<em&gt; BVR</em&gt; Gen) bajo el control de la UAS se mantuvo en silencio ante la ausencia de transactivación GAL4 en el padre UAS-BVR<sup&gt; 4</sup&gt;. Cruces genéticos entre una línea UAS-BVR transgénicos y un GAL4-GFP trampa potenciador resultado en la línea de expresión específica de la<em&gt; BVR</em&gt; Gen en las células marcadas por<em&gt; GFP</em&gt; Expresión<sup&gt; 4</sup&gt;. BVR acumulación en los resultados de las plantas de Arabidopsis en la deficiencia de cromóforo fitocromo<em&gt; En la planta</em<sup&gt; 5.7</sup&gt;. Por lo tanto, las plantas transgénicas que se han producido exhibición GAL4-dependiente de la activación de la<em&gt; BVR</emGen&gt;, lo que resulta en la inactivación del fitocromo bioquímicos, así como GAL4-dependiente<em&gt; GFP</em&gt; Expresión. Los análisis genéticos y moleculares de fotobiológicos<em&gt; BVR</em&gt; Líneas transgénicas están dando idea de los tejidos y órganos específicos fitocromo respuestas mediadas que se han asociado con los sitios correspondientes de photoperception<sup&gt; 4, 7, 8</sup&gt;. Fluorescencia de células activadas por la clasificación (FACS) de la GFP-positivo, potenciador trampa inducida<em&gt; BVR</em&gt; Expresan protoplastos de la planta junto con células de tipo específico de perfiles de expresión génica a través de análisis de microarrays se utiliza para identificar putativo genes diana posterior implicados en la mediación espacial de las respuestas específicas fitocromo. Esta investigación se está expandiendo nuestro conocimiento de los lugares de percepción de la luz, los mecanismos mediante los cuales los distintos tejidos u órganos colaborar en el crecimiento de plantas de luz regulada y desarrollo, y avanzar en la disección molecular de los complejos fitocromo mediada por la célula a célula de cascadas de señalización.

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Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

La base molecular de las respuestas específicas de espacio-fitocromo está siendo investigado el uso de plantas transgénicas que presentan los tejidos y órganos específicos deficiencias fitocromo. El aislamiento de células específicas exhibir agotamiento inducido cromóforo fitocromo por fluorescencia de células activadas clasificación seguido por análisis de microarrays se está utilizando para identificar genes implicados en el espacio-las respuestas específicas de fitocromo.

La investigación de los tejidos y órganos específicos de las respuestas fitocromo usando FACS asistida por células de tipo Perfiles de expresión específica en Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

investigating-tissue-organ-specific-phytochrome-responses-using-facs

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

15.7K vistas.  Michigan State University (MSU). La base molecular de las respuestas específicas de espacio-fitocromo está siendo investigado el uso de plantas transgénicas que presentan los tejidos y órganos específicos deficiencias fitocromo. El aislamiento de células específicas exhibir agotamiento inducido cromóforo fitocromo por fluorescencia de células activadas clasificación seguido por análisis de microarrays se está utilizando para identificar genes implicados en el espacio-las respuestas específic...

Video: Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&amp;#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floral dip transformación de la Arabidopsis thaliana Para el Examen de PTSO2:: β-glucuronidasa Reporter Expresión Génica

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Investigación

Biología

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling. These proteins display a diverse array of cellular functions including nuclear import/export of RNA and protein, transcriptional regulation, and apoptosis. Interestingly, major cellular reorganizations including cell division, differentiation and transformation, often involve such activities3,4,8,10. The detailed study of these proteins and their respective regulatory mechanisms can be challenging as the stimulation for these localization changes can be elusive, and the movements themselves can be quite dynamic and difficult to track. Studies involving cellular oncogenesis, for example, continue to benefit from understanding pathways and protein activities that differ between normal primary cells and transformed cells6,7,11,12. As many proteins show altered localization during transformation or as a result of transformation, methods to efficiently characterize these proteins and the pathways in which they participate stand to improve the understanding of oncogenesis and open new areas for drug targeting.
Here we present a method for the analysis of protein trafficking and shuttling activity between primary and transformed mammalian cells. This method combines the generation of heterokaryon fusions with fluorescence microscopy to provide a flexible protocol that can be used to detect steady-state or dynamic protein localizations. As shown in Figure 1, two separate cell types are transiently transfected with plasmid constructs bearing a fluoroprotein gene attached to the gene of interest. After expression, the cells are fused using polyethylene glycol, and protein localizations may then be imaged using a variety of methods. The protocol presented here is a fundamental approach to which specialized techniques may be added.

A flexible and efficient method for the characterization of cell type-specific protein localization and nucleocytoplasmic shuttling is described. This heterokaryon approach uses fluorescently-labeled fusion proteins to image protein localizations after cell fusion. The protocol is amenable to steady-state localizations or more dynamic determinations based on live cell imaging.

Heterocarión Técnica para el Análisis de tipo de células específicas de localización

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine, form bilayer membranes which act as both boundaries and interfaces for chemical exchange between cells and their surroundings. Unlike animals, plant cells have a special organelle for photosynthesis, the chloroplast. The intricate membrane system of the chloroplast contains unique glycerolipids, namely glycolipids lacking phosphorus: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG)4. The roles of these lipids are beyond simply structural. These glycolipids and other glycerolipids were found in the crystal structures of photosystem I and II indicating the involvement of glycerolipids in photosynthesis8,11. During phosphate starvation, DGDG is transferred to extraplastidic membranes to compensate the loss of phospholipids9,12.
Much of our knowledge of the biosynthesis and function of these lipids has been derived from a combination of genetic and biochemical studies with Arabidopsis thaliana14. During these studies, a simple procedure for the analysis of polar lipids has been essential for the screening and analysis of lipid mutants and will be outlined in detail. A leaf lipid extract is first separated by thin layer chromatography (TLC) and glycerolipids are stained reversibly with iodine vapor. The individual lipids are scraped from the TLC plate and converted to fatty acyl methylesters (FAMEs), which are analyzed by gas-liquid chromatography coupled with flame ionization detection (FID-GLC) (Figure 1). This method has been proven to be a reliable tool for mutant screening. For example, the tgd1,2,3,4 endoplasmic reticulum-to-plastid lipid trafficking mutants were discovered based on the accumulation of an abnormal galactoglycerolipid: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) and a decrease in the relative amount of 18:3 (carbons : double bonds) fatty acyl groups in membrane lipids 3,13,18,20. This method is also applicable for determining enzymatic activities of proteins using lipids as substrate6.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Composition of polar lipid extracts and the fatty acid composition of individual glycerolipids are determined in a simple and robust lipid profiling experiment. For this purpose, glycerolipids are isolated by thin layer chromatography and subjected to transmethylation of their acyl groups. Fatty acyl methylesters are quantified by gas-liquid chromatography.

Perfiles de Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid por cromatografía en capa fina (TLC), junto con cromatografía de gases (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Alta resolución Cuantificación de celulosa cristalina acumulación en<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Las raíces para monitorear la célula específica de tejido de pared Modificaciones

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Perfiles de celular-tipo-específico epigenoma

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

Perfilado de expresión génica específico del tipo de celda en el hígado del ratón

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

Secuenciación de ARN-Secuenciación de ARN-Captura láser para Análisis de Expresión Genética Espacial y Temporal Específica de Tejidos en Plantas

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids potential pitfalls caused by the heterogeneity of tissues and unleashes the powerful transcriptome analysis. The protocol described here demonstrates how to use the Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) method to isolate ribosome-bound RNAs from a small amount of EGFP-expressing cells in a complex tissue without cell sorting. This protocol is suitable for isolating cell-type-specific RNAs using the recently available NuTRAP mouse model and could also be used to isolate RNAs from any EGFP-expressing cells.

This protocol aims to isolate cell-type-specific translating ribosomal mRNAs using the NuTRAP mouse model.

Aislar ARN específicos del tipo de célula de muestras de tejido heterogéneo congeladas a presión sin clasificación celular

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...

Un método mejorado para medir los perfiles de hidratación del polen en Arabidopsis thaliana

A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is established between the interacting partners. Studies across a range of species have revealed that a series of molecular checkpoints regulate the pollen-stigma interaction to ensure that only compatible, generally intraspecific pollen is successful in effecting fertilization. In species that possess a 'dry stigma', such as the model plant Arabidopsis thaliana, the first post-pollination, prezygotic compatibility checkpoint is the establishment of pollen hydration. 
This phase of pollination is tightly regulated, whereby signals from the pollen grain elicit the release of water from the stigma, thus permitting pollen hydration. The ability to accurately measure and track pollen hydration over time is key to the design of experiments directed at understanding the regulation of this critical step in reproduction. Published protocols frequently utilize flowers that have been excised from the parent plant, maintained on liquid or solid media, and bulk pollinated. 
This paper describes a noninvasive, in vivo pollination bioassay that permits minute-by-minute hydration tracking of individual A. thaliana pollen grains at high resolution. The assay is highly reproducible, able to detect very subtle variations of pollen hydration profiles, and thus is suitable for the analysis of mutants that affect pathways regulating pollination. Although the protocol is lengthier than those described for bulk pollinations, the precision and reproducibility it provides, along with its in vivo nature, make it ideal for the detailed dissection of pollination phenotypes.

Autor destacado: Un bioensayo de hidratación de polen in vivo de alta resolución, de un solo grano para Arabidopsis thaliana  

An improved method to measure pollen hydration profiles in Arabidopsis thaliana is described here. The new method offers higher resolution, is noninvasive, and is highly reproducible. The protocol represents a new tool for a finer dissection of the processes that regulate the early stages of pollination.

Un bioensayo de hidratación de polen in vivo de grano único de alta resolución para Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is ...