Trabalho no laboratório Montgomery nas respostas fitocromo em plantas é apoiado pela National Science Foundation (Grant no. MCB-0919100 para BLM) e Ciências Químicas, Geociências e Biociências Divisão do Escritório de ciências básicas da energia, o Office of Science, EUA Departamento de energia (não concedem. FG02 DE 91ER20021 a BLM). Agradecemos a Melissa Whitaker de assistência técnica durante as filmagens e leitura crítica do manuscrito, Stephanie Costigan de assistência experimental, Dr. Luís Rei de assistência ao desenvolvimento e otimização de fluorescência-Activated Celular classificação protocolos para a classificação de protoplastos Arabidopsis e Frame Dr. Melinda para assistência com confocal microscopia. Agradecemos a Marlene Cameron para a assistência de design gráfico e Bird Karen de assistência editorial.

1. Crescimento da Planta <ol><li> Confirmado UAS-BVR X GAL4-GFP linha armadilha enhancer isoladas como descrito 4 (Para um resumo ver Fig. 1.) E as linhas do tipo selvagem ou parental são semeadas em solo, ou seja, ~ 2000 sementes esterilizadas por linha. </li><li> As plantas são cultivadas por 5 semanas em solo sob iluminação branca de 100 μmolm -2 s -1 a 22 ° C e umidade de 70%. </li></ol> 2. Folha de protoplastos de isolamento (adaptado de Denecke Vitale e 9) <ol><li> Para isolar protoplastos, prepare TEX buffer. Para um buffer de litros TEX, pesar os seguintes componentes: 3,1 g sais Gamborg do B5, 0,5 g 2 - (N-morfolino) etanosulfónico (MES, 2,56 mM), 0,75 g cloreto de cálcio dihidratado (CaCl 2 .2 H 2 O, 6,75 mM), 0,25 g nitrato de amónio (NH 4 NO 3, 3,12 mM), 136,9 g de sacarose (0,4). Dissolve componentes completamente em ~ 900 ml de água, deionizada (DDH 2 O) e trazer o pH para 5,7 com 1 M KOH. Trazer um volume final de 1 litro e filtro de esterilizar com uma garrafa de 0,2 m top-filtro ligado a uma bomba de vácuo. </li><li> Colete verde, folhas sadias de plantas (~ 250 ml de folhas ligeiramente comprimido em um copo) e enxaguar com ~ 40 ml DDH 2 O 4 vezes, seguido de lavagem duas vezes com estéril DDH 2 O. Usando um bisturi # 20, as folhas cortadas em tiras finas e dividir o tecido igualmente em dois tubos de 50 ml de plástico estéril. Prepare 1x mistura de digestão de folhas, adicionando 5 ml de alíquota 10x solução estoque folha digestão (10x folha solução estoque digestão: dissolver 2% w / v Macerozyme R-10, 4% w / v celulase &quot;Onozuka&quot; R-10 em TEX buffer, filtro de esterilizar com 0,2 m de filtro e congelar alíquotas 5 ml a -80 ° C) a 45 ml de tampão TEX fresco. Adicionar ~ 25 ml de 1x mix de folhas digestão por 50 ml tubo para cobrir todo o tecido da folha. </li><li> Vácuo infiltrar tecido foliar em mistura de digestão em tubos abertos para 1 hora em temperatura ambiente usando um exsicador de vácuo conectada a uma bomba de água, seguido de 3 horas de incubação a temperatura ambiente em um rocker, agitando suavemente. Tubos tampados com tecido foliar no mix de folhas 1x digestão são mantidos embrulhados em papel alumínio durante este processo para evitar a exposição à luz. </li><li> Após 3 horas, aumentar a velocidade rocker por aproximadamente 2 minutos para liberação de protoplastos. Filtrar a suspensão de protoplastos bruto por meio de duas camadas de pano de queijo estéril para remover detritos e recolher o filtrado em um copo de vidro esterilizado. Filtrar o filtrado através de uma malha de nylon estéril 100 mícrons em uma placa de Petri estéril. Recolher o fluxo através de e transferi-lo para um tubo novo ml estéril 50. Use cerca de 15-20 ml de tampão TEX fresca para lavar a placa de Petri estéril e coletar qualquer protoplastos aderindo à superfície. </li><li> Centrifugar o fluxo através da utilização de um rotor balde swing em 100xg a 10 ° C por 15 min (6 Aceleração, Desaceleração 0). </li><li> Remover ~ 25 - 30 ml do líquido abaixo da camada flutuante de protoplastos, que contém os restos residuais e peletizada, com uma estéril 9 &quot;de vidro Pasteur pipeta conectado a uma bomba peristáltica, sem perturbar a camada flutuante de protoplastos e deixando ~ 10-15 ml de volume. </li><li> Adicionar tampão TEX fresco para um volume final de 40 ml, enquanto delicadamente ressuspender a protoplastos. </li><li> Repita os passos 2,5-2,7 duas vezes para remover o máximo possível os restos celulares. O tempo de centrifugação é reduzida para 10 minutos na primeira repetição e cinco minutos na repetição final. </li><li> Aspirar protoplastos flutuante com um corte, uma pipeta de transferência estéril ml em um tubo ml novo 15. Prosseguir diretamente para a classificação ou armazenar no escuro por até 2 horas a 4 ° C até a classificação. </li></ol> 3. Classificando de protoplastos por Fluorescência-activated cell sorting (FACS) <ol><li> Antes da separação, examine protoplastos por Microscopia Confocal Laser Scanning (CLSM) usando um laser de 488 nm para excitação para confirmar a integridade de protoplastos ea presença de fluorescência da GFP na piscina de protoplastos. Detritos mínima é necessária para evitar o entupimento do bico de classificação FACS. </li><li> Ordenar protoplastos isolados em TEX tampão via FACS (BD FACSVantage SE, BD Biosciences), utilizando um bico 200 mícrons em uma cabeça tipo macro na taxa de eventos entre 6.000 e 15.000, com um sistema de pressão de cerca de 9 psi na sequência de um protocolo adaptado 10. </li><li> Tipo selvagem não GFP-protoplastos são usados ​​para determinar os limiares autofluorescência. </li><li> Para coletar GFP positivas protoplastos, células de ordenação usando um ar-refrigerado laser de argônio (Spectra Physics Modelo 177 de Newport Corporation, Irvine, CA) operado com 100 mW em uma linha de argônio 488-nm para identificar GFP fluorescência usando uma banda 530/30 filtro passa. </li><li> Após a coleta de GFP-positivos protoplastos, examine protoplastos classificadas por CLSM conforme detalhado no passo 3.1. </li><li> Extrato de RNA total a partir de protoplastos classificados usando um Qiagen Usina RNeasy Kit Mini. cDNA pode então ser preparado para hibridação, conforme descrito no Affymetrix GeneChip ExprManual de Análise Técnica e ession então hibridizado com ATH1 Arabidopsis Affymetrix arrays genoma inteiro. </li></ol> Resultados representante Detectamos um número significativo de células positivas para GFP-no canal de GFP por FACS (Fig. 2). Em ensaios de otimização usando GFP enhancer trap-pais, o constitutivamente expressando GFP-line, J0571, exibido ~ 17% a 24% GFP positivas protoplastos, enquanto que a linha com a expressão vascular e cutânea, J1071, tinha ~ 1,4% GFP positivas protoplastos (Tabela 1). Classificação de 3 x 500 mL (~ total de 1,5 ml de suspensão de protoplastos) de J0571 protoplastos por 1 h ~ GFP deu positivo 100.000 protoplastos. Classificação de 3 x 500 mL (~ 1,5 ml de suspensão de protoplastos total) de J1071 protoplastos por 1,5 h deu ~ 3000 GFP positivas protoplastos. Imagens confocal indicaram um rendimento muito elevado de protoplastos para amostras tanto J0571 e J1071 antes da separação foi realizada (Fig. 3C e 3E), e as frações classificadas continha apenas brilhante fluorescente GFP-protoplastos (Fig. 3G e dados não mostrados). Este achado confirma que intacta GFP positivas protoplastos podem ser classificados através FACS. Os protoplastos não GFP também podem ser classificados e recolhidos em um canal separado. Os protoplastos não GFP servir como um controle ideal negativo para análises posteriores microarray para detectar as alterações na expressão de genes específicos na redução dos níveis de holophytochrome. A extração de RNA a partir de protoplastos isolados (1 ml) produz RNA em quantidade suficiente para a detecção por fluorospectrometry (Fig. 4). Isolado RNA foi avaliada através de um instrumento NanoDrop (NanoDrop 1000, Thermo Scientific) e quantificados por NanoDrop software quantificação 3.7.1 RNA. Produz RNA a partir de pré-classificados C24 do tipo selvagem ou protoplastos FACS-classificados, GFP-positivos protoplastos armadilha enhancer excedeu o ng 20 mínimos necessários para utilização em RNA-rotulagem ensaios para microarray (Tabela 2). <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Enhancer Linha Armadilha </td><td> % Da GFP positivas protoplastos </td><td> Número de protoplastos GFP classificadas </td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 17,18% ~ 24,06% </td><td> 26400 ~ 36000 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> ~ 1,43% </td><td> 1000 ~ 1300 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Percentagem de GFP-positivos protoplastos de duas linhas enhancer trap antes da separação e do número de GFP-positivos protoplastos coletados, executando 500 mL da suspensão de protoplastos através da fluorescência celular Sorter Ativado (FACSVantage, BD). <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Linha de plantas </td><td> RNA rendimento (ng) </td></tr><tr><td> C24 WT </td><td> 12486,5 </td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> 71,5 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Rendimento de RNA isolamento de protoplastos. RNA foi isolado a partir de pré-classificados C24 do tipo selvagem ou classificados GFP positivas protoplastos a partir de duas linhas armadilha enhancer e quantificados. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. GAL4 enhancer-trap baseada indução de biliverdina redutase (BVR) expressão em plantas transgênicas de Arabidopsis thaliana. (A). Um indivíduo selecionado de uma biblioteca de GAL4 baseado linhas enhancer trap, que contêm um GAL4-responsive gene marcador GFP, pode ser cruzada com uma linha contendo um gene-alvo GAL4 de resposta para induzir a expressão do gene alvo em GAL4 contendo células marcadas GFP por fluorescência. Baseado em uma figura do Dr. Jim Haseloff (http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html). (B) Produção de fitocromo cromóforo, phytochromobilin (PΦB) e holophytochrome em linhas pai. (C) esquerda, redução da biliverdina IXα (BV IXα) e pela biliverdina redutase PΦB (BVR) atividade a BR e PΦR, respectivamente. Atividade resulta em depleção de BVR PΦB e leva a uma redução na produção de fotoativo holophytochrome. Direita, a reação catalisada pela BVR é mostrado. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Separação de células de fluorescência Ativado (FACS) parcelas dot aquisição. Comparação de células de protoplastos de classificação para C24 do tipo selvagem (A), J0571 (B) e J1071 (C). (A) gráfico de pontos Aquisição de não-fluorescente GFP C24 do tipo selvagem protoplastos animado por um 488-nm laser de argônio e usado para determinar o limiar autofluorescência. (B) e (C) parcelas dot aquisição mostram proporções de protoplastos, que são GFP positivas em resposta à excitação por um laser 488 nm. R3 portões classificação em B e C delimitar as metas GFP-positivos que foram ordenados por Fluorescência-Activated Sorter Cell (FACSVantage, BD) e recolhidos. Canal vermelho indica valores de autofluorescência de clorofila a partir de protoplastos e canal verde indica valores para GFP fluorescência. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Microscopia confocal de protoplastos de plantas utilizadas na separação de células. Confocal a laser imagens digitalizadas antes de protoplastos (A, C, E) e depois (G) a classificação através de fluorescência-Activated Sorter Cell (FACS). B, D, F e H são imagens DIC. Protoplastos de C24 do tipo selvagem (A, B), J1071 (C, D) e J0571 (E, F, G, H) são mostrados. Imagens C, E e G são mescladas imagens de fluorescência da GFP (BP 505 nm - 575 nm) e autofluorescência (LP 650 nm) obtidos a partir de excitação com um laser 488 nm. A a H são média de 4 scans sob óleo 63x. Bar = 10 mM. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Quantificação do RNA isolado de protoplastos por fluorospectrometry. RNA extraído de (A) do tipo C24 selvagem, (B) J0571, e (C) J1071. A indica RNA para a pré-classificadas do tipo selvagem protoplastos. B e C indicam RNA de GFP-positivos protoplastos classificadas por Fluorescência-activated cell sorting (FACS). RNA software de quantificação, NanoDrop 3.7.1, (NanoDrop 1000, Thermo Scientific).

<ol>
	<li>Franklin, K. A., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochrome+functions+in+Arabidopsis+development.">Phytochrome functions in Arabidopsis development.</a> J. Exp. Bot. 61, 11-24 (2010).</li><li>Montgomery, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Right+place,+right+time:+Spatiotemporal+light+regulation+of+plant+growth+and+development.">Right place, right time: Spatiotemporal light regulation of plant growth and development.</a> Plant Signal Behav. 3, 1053-1060 (2008).</li><li>Laplaze, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4-GFP+enhancer+trap+lines+for+genetic+manipulation+of+lateral+root+development+in+Arabidopsis+thaliana.">GAL4-GFP enhancer trap lines for genetic manipulation of lateral root development in Arabidopsis thaliana.</a> J. Exp. Bot. 56, 2433-2442 (2005).</li><li>Costigan, S., Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root-localized+phytochrome+chromophore+synthesis+is+required+for+tissue-specific+photoregulation+of+root+elongation+and+impacts+sensitivity+to+jasmonic+acid+in+Arabidopsis+thaliana.">Root-localized phytochrome chromophore synthesis is required for tissue-specific photoregulation of root elongation and impacts sensitivity to jasmonic acid in Arabidopsis thaliana.</a> , .</li><li>Lagarias, D. M., Crepeau, M. W., Maines, M. D., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+photomorphogenesis+by+expression+of+mammalian+biliverdin+reductase+in+transgenic+Arabidopsis+plants.">Regulation of photomorphogenesis by expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants.</a> Plant Cell. , 675-688 (1997).</li><li>Montgomery, B. L., Yeh, K. C., Crepeau, M. W., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+distinct+aspects+of+photomorphogenesis+via+targeted+expression+of+mammalian+biliverdin+reductase+in+transgenic+Arabidopsis+plants.">Modification of distinct aspects of photomorphogenesis via targeted expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants.</a> Plant Physiol. 121, 629-639 (1999).</li><li>Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+anthocyanin+accumulation+and+phytochromes+in+Arabidopsis+thaliana.">Light-dependent anthocyanin accumulation and phytochromes in Arabidopsis thaliana.</a> , .</li><li>Denecke, J., Vitale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+protoplasts+to+study+protein+synthesis+and+transport+by+the+plant+endomembrane+system.">The use of protoplasts to study protein synthesis and transport by the plant endomembrane system.</a> Methods Cell Biol. 50, 335-348 (1995).</li><li>Birnbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+expression+profiling+in+plants+via+cell+sorting+of+protoplasts+from+fluorescent+reporter+lines.">Cell type-specific expression profiling in plants via cell sorting of protoplasts from fluorescent reporter lines.</a> Nat. 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Perfil de expressão gênica através de microarrays (1) indicou que mais de 30% dos genes em Arabidopsis mudas são leves regulamentados e 11 (2) identificou um vasto conjunto de genes que codificam proteínas de transdução de sinal de luz envolvidos na cascata de sinalização fitocromo 12, 13 . Tais experimentos sugerem que a luz induz a mudanças rápidas e de longo prazo na expressão genética. Cada pool de fitocromos pode controlar apenas um subconjunto de respostas de desenvolvimento e de...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Anti-BVR antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QED Bioscience Inc.</td>
<td>56257-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cellulase &#x201C;Onozuka&#x201D; R-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company</td>
<td>MSPC 0930</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gamborg&#x2019;s B5 basal salt mixture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Macerozyme R-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company</td>
<td>PTC 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MES, low moisture content</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M3671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Murashige and Skoog salts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caisson Laboratories</td>
<td>74904</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phytablend</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caisson Laboratories</td>
<td>28302</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNeasy Plant Minikit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>16419</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

investigating tissue- and organ-specific phytochrome responses using facs-assisted cell-type specific expression profiling in arabidopsis thaliana

Media luz uma série de processos de desenvolvimento e de adaptação ao longo do ciclo de vida de uma planta. Plantas utilizam a luz de absorção de moléculas chamadas fotorreceptores de sentir e adaptar-se a luz. O vermelho / vermelho-extremo de absorção de luz fotorreceptores fitocromo têm sido estudadas extensivamente. Fitocromos existir como uma família de proteínas com funções distintas e sobrepostas em todos os sistemas de plantas superiores em que foram estudados<sup&gt; 1</sup&gt;. Respostas mediadas por fitocromo luz, que vão desde a germinação de sementes através de floração e senescência, muitas vezes são localizadas em tecidos de plantas específicas ou órgãos<sup&gt; 2</sup&gt;. Apesar da descoberta e elucidação das funções individuais e redundantes fitocromo através de análises de mutação, os relatórios conclusivos sobre locais distintos de photoperception e os mecanismos moleculares de piscinas localizadas de fitocromos que medeiam espacial respostas específicas fitocromo são limitadas. Nós projetamos experimentos baseados em hipóteses que os sites específicos de photoperception fitocromo regular tecido e órgão os aspectos específicos da photomorphogenesis, e que piscinas localizadas fitocromo envolver subconjuntos distintos de genes-alvo a jusante na célula a célula de sinalização. Nós desenvolvemos uma abordagem bioquímica para seletivamente reduzir fitocromos funcional em um órgão ou tecido-específicas maneira dentro de plantas transgênicas. Nossos estudos são baseados em uma abordagem enhancer trap-bipartite que resulta em transativação da expressão de um gene sob o controle da ativação elemento Seqüência Upstream (UAS) do ativador transcricional GAL4<sup&gt; 3</sup&gt;. A biliverdina redutase (<em&gt; BVR</em&gt;) Gene sob o controle da UAS é mantido em silêncio, na ausência de transativação GAL4 no pai UAS-BVR<sup&gt; 4</sup&gt;. Cruzamentos genéticos entre uma linhagem transgênica UAS-BVR e um GAL4-GFP enhancer resultado linha de armadilha em expressão específica do<em&gt; BVR</em&gt; Gene nas células marcadas pela<em&gt; GFP</em&gt; Expressão<sup&gt; 4</sup&gt;. BVR acumulação em plantas de Arabidopsis resultados na deficiência cromóforo fitocromo<em&gt; Em planta</em<sup&gt; 07/05</sup&gt;. Assim, plantas transgênicas que temos produzido ativação exibem GAL4-dependente da<em&gt; BVR</em&gt; Gene, resultando na inativação bioquímicos do fitocromo, bem como GAL4-dependente<em&gt; GFP</em&gt; Expressão. Fotobiológicos molecular e análises genéticas de<em&gt; BVR</em&gt; Linhas de transgênicos estão rendendo introspecção em tecido e órgão-específicas mediadas por fitocromo respostas que têm sido associados a sites correspondentes de photoperception<sup&gt; 4, 7, 8</sup&gt;. Separação de células de fluorescência Ativado (FACS) da GFP-positivo, enhancer-armadilha induzida<em&gt; BVR</emProtoplastos&gt; expressando planta juntamente com células de tipo específico de perfil de expressão gênica através da análise de microarray está sendo usado para identificar supostos genes alvo downstream envolvidos na mediação espacial respostas específicas fitocromo. Esta pesquisa está se expandindo a nossa compreensão dos sítios de percepção de luz, os mecanismos através dos quais vários tecidos ou órgãos cooperam entre si à luz regulado o crescimento das plantas e desenvolvimento, e promover a dissecção molecular do fitocromo mediada por complexo celular-para-celular cascatas de sinalização.

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Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

A base molecular do espaço-respostas específicas fitocromo está sendo investigado o uso de plantas transgênicas que apresentam tecidos e órgãos específicos deficiências fitocromo. O isolamento de células específicas exibindo esgotamento cromóforo fitocromo induzida por fluorescência-Activated Celular classificação seguido por análises de microarray está sendo utilizada para identificar genes envolvidos em respostas espaciais específicos fitocromo.

Investigando Tecido e órgãos específicos Responses Fitocromo usando FACS assistida Célula tipo Profiling expressão específica no Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

investigating-tissue-organ-specific-phytochrome-responses-using-facs

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

15.7K visualizações.  Michigan State University (MSU). A base molecular do espaço-respostas específicas fitocromo está sendo investigado o uso de plantas transgênicas que apresentam tecidos e órgãos específicos deficiências fitocromo. O isolamento de células específicas exibindo esgotamento cromóforo fitocromo induzida por fluorescência-Activated Celular classificação seguido por análises de microarray está sendo utilizada para identificar genes envolvidos em respostas espaciais específicos fitocromo.

Vídeo: Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&amp;#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floral-dip Transformação de Arabidopsis thaliana Examine a PTSO2:: β-glucuronidase Expressão Gênica Reporter

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Biologia

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling. These proteins display a diverse array of cellular functions including nuclear import/export of RNA and protein, transcriptional regulation, and apoptosis. Interestingly, major cellular reorganizations including cell division, differentiation and transformation, often involve such activities3,4,8,10. The detailed study of these proteins and their respective regulatory mechanisms can be challenging as the stimulation for these localization changes can be elusive, and the movements themselves can be quite dynamic and difficult to track. Studies involving cellular oncogenesis, for example, continue to benefit from understanding pathways and protein activities that differ between normal primary cells and transformed cells6,7,11,12. As many proteins show altered localization during transformation or as a result of transformation, methods to efficiently characterize these proteins and the pathways in which they participate stand to improve the understanding of oncogenesis and open new areas for drug targeting.
Here we present a method for the analysis of protein trafficking and shuttling activity between primary and transformed mammalian cells. This method combines the generation of heterokaryon fusions with fluorescence microscopy to provide a flexible protocol that can be used to detect steady-state or dynamic protein localizations. As shown in Figure 1, two separate cell types are transiently transfected with plasmid constructs bearing a fluoroprotein gene attached to the gene of interest. After expression, the cells are fused using polyethylene glycol, and protein localizations may then be imaged using a variety of methods. The protocol presented here is a fundamental approach to which specialized techniques may be added.

A flexible and efficient method for the characterization of cell type-specific protein localization and nucleocytoplasmic shuttling is described. This heterokaryon approach uses fluorescently-labeled fusion proteins to image protein localizations after cell fusion. The protocol is amenable to steady-state localizations or more dynamic determinations based on live cell imaging.

Técnica heterocário para Análise de Localização Celular Tipo específico

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine, form bilayer membranes which act as both boundaries and interfaces for chemical exchange between cells and their surroundings. Unlike animals, plant cells have a special organelle for photosynthesis, the chloroplast. The intricate membrane system of the chloroplast contains unique glycerolipids, namely glycolipids lacking phosphorus: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG)4. The roles of these lipids are beyond simply structural. These glycolipids and other glycerolipids were found in the crystal structures of photosystem I and II indicating the involvement of glycerolipids in photosynthesis8,11. During phosphate starvation, DGDG is transferred to extraplastidic membranes to compensate the loss of phospholipids9,12.
Much of our knowledge of the biosynthesis and function of these lipids has been derived from a combination of genetic and biochemical studies with Arabidopsis thaliana14. During these studies, a simple procedure for the analysis of polar lipids has been essential for the screening and analysis of lipid mutants and will be outlined in detail. A leaf lipid extract is first separated by thin layer chromatography (TLC) and glycerolipids are stained reversibly with iodine vapor. The individual lipids are scraped from the TLC plate and converted to fatty acyl methylesters (FAMEs), which are analyzed by gas-liquid chromatography coupled with flame ionization detection (FID-GLC) (Figure 1). This method has been proven to be a reliable tool for mutant screening. For example, the tgd1,2,3,4 endoplasmic reticulum-to-plastid lipid trafficking mutants were discovered based on the accumulation of an abnormal galactoglycerolipid: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) and a decrease in the relative amount of 18:3 (carbons : double bonds) fatty acyl groups in membrane lipids 3,13,18,20. This method is also applicable for determining enzymatic activities of proteins using lipids as substrate6.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Composition of polar lipid extracts and the fatty acid composition of individual glycerolipids are determined in a simple and robust lipid profiling experiment. For this purpose, glycerolipids are isolated by thin layer chromatography and subjected to transmethylation of their acyl groups. Fatty acyl methylesters are quantified by gas-liquid chromatography.

Arabidopsis thaliana Profiling Glycerolipid Polar por cromatografia em camada delgada (TLC) Juntamente com Cromatografia gás-líquido (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Quantificação de alta resolução Celulose cristalina Acumulação em<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Raízes para monitorar celular específico do tecido da parede Modificações

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Epigenoma célula tipo-específicas de criação de perfil

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

Perfil de expressão gênica específica do tipo de célula no fígado do mouse

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

Microdissection laser RNA-Sequenciamento para Análise de Expressão Genética Espacial e Temporal-Específica do Tecido em Plantas

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids potential pitfalls caused by the heterogeneity of tissues and unleashes the powerful transcriptome analysis. The protocol described here demonstrates how to use the Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) method to isolate ribosome-bound RNAs from a small amount of EGFP-expressing cells in a complex tissue without cell sorting. This protocol is suitable for isolating cell-type-specific RNAs using the recently available NuTRAP mouse model and could also be used to isolate RNAs from any EGFP-expressing cells.

This protocol aims to isolate cell-type-specific translating ribosomal mRNAs using the NuTRAP mouse model.

Isole RNAs específicos do tipo celular de amostras de tecido heterogêneo congeladas sem triagem celular

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...

Um método aprimorado para medir os perfis de hidratação do pólen em Arabidopsis thaliana

A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is established between the interacting partners. Studies across a range of species have revealed that a series of molecular checkpoints regulate the pollen-stigma interaction to ensure that only compatible, generally intraspecific pollen is successful in effecting fertilization. In species that possess a 'dry stigma', such as the model plant Arabidopsis thaliana, the first post-pollination, prezygotic compatibility checkpoint is the establishment of pollen hydration. 
This phase of pollination is tightly regulated, whereby signals from the pollen grain elicit the release of water from the stigma, thus permitting pollen hydration. The ability to accurately measure and track pollen hydration over time is key to the design of experiments directed at understanding the regulation of this critical step in reproduction. Published protocols frequently utilize flowers that have been excised from the parent plant, maintained on liquid or solid media, and bulk pollinated. 
This paper describes a noninvasive, in vivo pollination bioassay that permits minute-by-minute hydration tracking of individual A. thaliana pollen grains at high resolution. The assay is highly reproducible, able to detect very subtle variations of pollen hydration profiles, and thus is suitable for the analysis of mutants that affect pathways regulating pollination. Although the protocol is lengthier than those described for bulk pollinations, the precision and reproducibility it provides, along with its in vivo nature, make it ideal for the detailed dissection of pollination phenotypes.

Autor em destaque: Um bioensaio de hidratação de pólen in vivo de alta resolução, grão único para Arabidopsis thaliana  

An improved method to measure pollen hydration profiles in Arabidopsis thaliana is described here. The new method offers higher resolution, is noninvasive, and is highly reproducible. The protocol represents a new tool for a finer dissection of the processes that regulate the early stages of pollination.

Bioensaio de Hidratação Polínica In Vivo de Grão Único de Alta Resolução para Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is ...