Este método puede ayudar a responder a la regulación espaciotemporal de un gen de interés durante un evento biológico dinámico como la inmunidad en las hojas intactas de la arabidopsis. La principal ventaja de esta técnica es que nos permite capturar la dinámica espaciotemporal de la actividad promotora en suelos cultivados intactos hojas de plantas durante pocos días. Para comenzar este procedimiento, llene una bandeja de tapón de celda de plástico con suelo autoclavado.
Siembra una semilla de arabidopsis transgénica en cada célula. Transfiera la bandeja a una sala de crecimiento que se mantenga a 23 grados centígrados y haga crecer las plantas en condiciones continuas de luz blanca durante dos a tres semanas. Dos días antes de la inoculación del patógeno, rayar el patógeno que transporta avrRpt2 de una población de glicerol en un medio DE NYG que contiene rifampicina a 100 miligramos por litro y kanamicina a 50 miligramos por litro.
Incubar a 28 grados Centígrados durante 48 horas. Usando puntas de plástico, cosecha las células bacterianas que aparecen en la superficie del medio. Transfiera las bacterias a un tubo de plástico que contenga cloruro de magnesio de 10 milimolar y resuspenderlas.
A continuación, mida la densidad óptica de la solución a 600 nanómetros. Ajustar la concentración final de células bacterianas a 100 millones de unidades formadoras de colonias por mililitro que normalmente corresponde a un OD600 de 0,2. Primero, corte cuidadosamente un tapón celular que contenga una planta de dos a tres semanas de edad asegurándose de no dañar la planta.
Establezca la celda en una bandeja de tapón de celda vacía para mantener un buen equilibrio. Seleccione una hoja visiblemente sana para la inoculación. Tomando nota de que, generalmente, la tercera, cuarta y quinta hojas de la parte inferior de la planta son fáciles de manejar.
Regar el suelo que contiene la planta antes de la inoculación para obtener imágenes de lapso de tiempo a largo plazo. Opcionalmente, al analizar promotores sensibles al estrés examinan las hojas bajo un estereomicroscopio de fluorescencia antes de la inoculación del patógeno para verificar la ausencia de señal YFP. A continuación, póngase guantes de látex desechables para evitar el contacto directo con el patógeno durante la infiltración.
Con una jeringa de plástico sin aguja de un mililitro, infírte cuidadosamente en el lado abaxial de la hoja con la suspensión bacteriana. La inoculación de una pequeña porción en la mitad de la hoja permite una buena visualización de la actividad promotora de PR1. Utilice una toalla de papel suave para absorber cualquier exceso de suspensión bacteriana del área que rodea el área infiltrada en la hoja infiltrada.
Inmediatamente después de la inoculación, utilice cinta quirúrgica para fijar un portaobjetos de vidrio a la bandeja de plástico de tal manera que la hoja infiltrada se encuentre en el centro de la corredera de vidrio. Asegúrese de que la hoja inoculada esté completamente montada dentro del portaobjetos de vidrio. Corta un trozo de cinta de plástico de doble capa en dos piezas para encajar los espacios a lo largo del pecíolo de la hoja infiltrada, y corta una esquina de cada pieza.
Usando un par de pinzas finas, pegue estos trozos de cinta a cada lado del pecíolo de tal manera que las esquinas cortadas de cada pieza se alineen con la base de la hoja, asegurándose de que las piezas de cinta no toquen el pecíolo o la hoja. A continuación, prepare una pieza adicional de cinta de plástico de doble capa como se describe en la figura dos del protocolo de texto. Pegue este trozo de cinta en la parte superior de las piezas previamente adheridas para formar un puente sobre el pecíolo, teniendo cuidado de no atrapar el pecíolo o la hoja directamente entre las piezas de cinta.
A continuación, pegue suavemente un pequeño trozo de cinta quirúrgica en el portaobjetos de vidrio por encima de la punta de la hoja para que se fije muy suavemente en la diapositiva. Presione firmemente sólo en la parte de la cinta que está tocando directamente la diapositiva de vidrio. Coloque suavemente otro pequeño trozo de cinta quirúrgica en el borde del pecíolo y las piezas de cinta de plástico para que el pecíolo se fije muy suavemente tanto en la corregida de vidrio como en las piezas de cinta de plástico, asegurándose de fijar firmemente la parte de la cinta quirúrgica que está tocando directamente el portaobjetos de vidrio o las piezas de cinta de plástico.
Inserte suavemente las puntas de la pipeta de 200 microlitrotro en el suelo para mantener suavemente las hojas vecinas lejos de la hoja infiltrada. Primero encienda el estereomicroscopio fluorescente. Establezca la planta en el espacio bajo la lente objetivo del estereomicroscopio para la toma de imágenes.
Configure los parámetros para la toma de imágenes de lapso de tiempo. Utilice el filtro YFP convencional para visualizar la señal YFP. Utilice el filtro Texas Red para visualizar la autofluorescencia de clorofila de modo que el dominio PCD sea visible como un área oscura rodeada por capas de celdas positivas de YFP.
A continuación, utilice la configuración de campo epi-brillante convencional para pasos de exposición a la luz adicionales, asegurándose de programar los pasos para la exposición a la luz durante el período de intervalo de la imagen de lapso de tiempo, ya que la luz tiene un impacto importante en la inmunidad de la planta. Ejecute el programa de imágenes de lapso de tiempo. Para la observación a largo plazo durante varios días, considere regar la planta adecuadamente.
Después de la adquisición de la imagen, omita los canales adicionales utilizados para la exposición a la luz en los intervalos del conjunto de datos. Mediante el software de análisis de imágenes, analice los datos con varios métodos, como el análisis de la región de interés. En este estudio, se demuestra un método versátil para el montaje de hojas de arabidopsis para imágenes intravitales de lapso de tiempo.
Un ejemplo representativo de datos de imagen de lapso de tiempo utilizando ETI inducida por avrRpt2 se obtiene como una serie de imágenes y como una película de lapso de tiempo. En experimentos exitosos utilizando pPR1-YPF-NLS durante la ETI inducida por avrRpt2, se observa la activación transitoria del promotor PR1, como se desprende de YFP que expresa focos y varias capas de células que rodean el dominio PCD. La activación del promotor PR1 en las células que rodean el dominio PCD generalmente comienza en aproximadamente cinco horas después de la inoculación, alcanza un pico de aproximadamente 12 horas después de la inoculación y dura hasta 40 horas después de la inoculación.
Al intentar este procedimiento, las condiciones de lapso de tiempo deben establecerse cuidadosamente como se describe en el texto. Siguiendo este procedimiento, la actividad promotora se puede analizar cuantitativa y cualitativamente, utilizando software de análisis. Estos análisis nos ayudan a explorar la dinámica espaciotemporal de la expresión génica en cualquier evento biológico que ocurra en hojas vivas de plantas de arabidopsis.
