Fondos aportados por el sur de Arizona Veterans Affairs Health Care Sistema VA Mérito de revisión de subvenciones 0142 y Arizona de Investigación Biomédica de la Comisión de subvención 0803.

Preparación de tejidos para ser visto en diapositivas <ol><li> Un colonoscopio se puede pasar en el colon a través del recto. Un colonoscopio es un tubo largo que tiene la iluminación y una cámara de vídeo a la cabeza, la habilidad de pasar el aire en el colon para hacerlo estallar como un globo largo para permitir una mejor visualización del colon, y tiene un pasaje de la pinza de biopsia que se pueden más allá de la cámara de vídeo para pellizcar un área de 5.3 milímetros de la superficie interior &quot;piel&quot; o capa de la mucosa del colon que nos dé una muestra de la biopsia. La pinza de biopsia también se puede utilizar para eliminar posibles pólipos precancerosos en el colon. </li><li> Se obtuvieron biopsias de tejidos normales la mucosa del colon de los pacientes, con el consentimiento informado. Estos pacientes fueron sometidos a una colonoscopia de cribado en una clínica gastrointestinal. Nuestra biopsias fueron colocados en frascos de formol. Después de 4 horas, la formalina fue reemplazado por el 70% de alcohol. </li><li> Muestras similares de tejido se tomaron de las áreas de las resecciones de colon, extirpar durante la cirugía, que fueron de 1 cm y 10 cm de distancia de los cánceres de colon o adenomas con neoplasia avanzada. Estas muestras de tejido también se colocaron en formol, y si las muestras de tejido fueron grandes, algunos se mantuvieron en formol para un período más largo antes de ser colocado en el 70% de alcohol. </li><li> Las muestras de tejido son llevados a un laboratorio de histología para ser procesados ​​y colocados en bloques de parafina. </li><li> Los bloques de parafina se enfrían en el refrigerador para que sean más fáciles de cortar por un microtomo. </li><li> Muestras de tejido de 4 micras de espesor se cortan de los bloques de tejido, usando un micrótomo, y flotaba sobre el agua. </li><li> Para comparar la expresión de dos proteínas, por ejemplo ERCC1 y PMS2, secciones de tejidos alternativos se pueden recoger en dos diapositivas, hasta que hay tres secciones de tejido en cada una de las dos diapositivas. Por ejemplo, las secciones 1, 3 y 5 se pueden colocar en una diapositiva etiquetados ERCC1 y los artículos 2, 4 y 6 se puede colocar en una diapositiva etiquetados PMS2. Tiene tres secciones de tejido para una proteína inmuno-en una sola diapositiva puede permitir que usted para ver si un patrón de coloración inusual de una cripta es un artefacto o es real, ya que los artefactos no se repetirá en la sección de tejido más de una en una diapositiva. Criptas del colon son alrededor de 60 micras de diámetro, por lo que cerca de 15 secciones de tejido puede ser cortado a través de una cripta, y la misma cripta puede verse en las secciones de tejido múltiple por diapositiva. </li></ol> Inmunotinción secciones de tejido <ol><li> Las diapositivas son puestos por el procedimiento de marcaje inmunohistoquímico. Este es un procedimiento de 8 horas, y es bastante estándar. Las partes del procedimiento que se utiliza, que no son estándar, son el uso de contenedores Sequenza para la tinción y el uso de una solución para reducir la tinción de fondo llamado &quot;Sniper&quot;. El &quot;francotirador&quot; La solución se vende como una fórmula patentada por Biocare Médica, Concord CA. </li><li> Algunos de los pasos de nuestros procedimientos se muestran aquí. </li><li> A modo de ejemplo, para PMS2 inmunohistoquímica, las diapositivas se deparaffinized primero poniendo en 3 cambios de xileno (3 minutos cada uno), seguidos por dos cambios en el 100% de etanol (2 minutos cada uno), seguidos por dos cambios en el 95% de etanol (2 minutos cada una), seguido de 2 cambios de agua destilada (2 minutos cada uno). Estos procedimientos se llevan a cabo bajo una campana química con presión de aire negativa, para que el experimentador no está expuesto a los vapores. </li><li> Cuando formalina se utilizó inicialmente para fijar los tejidos, partes de las proteínas en la muestra de tejido se reticulado. Ahora tenemos que romper los enlaces cruzados para que un anticuerpo capaz de reconocer la proteína de interés. Las diapositivas se colocan en una solución tampón que se pone a hervir en un horno de microondas. Esto es seguido por 10 minutos en la posición media, seguido de un enfriamiento de 20 minutos en hielo. Este paso tiene que ser probado y ajustado para microondas diferentes, hasta que se logran buenos resultados. Tenga en cuenta que para inmunoticción CCOI o Ku86 se utilizó un tampón de citrato de sodio hecho con ácido cítrico + 9 ml de citrato de sodio 41mL + 450 ml de H 2 O (una memoria intermedia entre los iones de sodio), que tenía un pH de alrededor de 6,0, por ERCC1 se utilizó un tampón de citrato de hecho con ácido cítrico 2,1 g + 1 litro de H 2 O + ~ 5 ml de hidróxido de sodio para llevar el pH a 6.1 (un buffer con un mínimo de iones de sodio en el original), y para PMS2 se utilizó una solución preparada con una solución de 5 ml desenmascarar el antígeno (por VECTOR) + 533mL H 2 O. Diferentes buffers son necesarios para aumentar la interacción de anticuerpos con epítopos proteína en particular. </li><li> Las diapositivas son puestos en peróxido de hidrógeno al 3% (diluido en metanol) durante 20 minutos seguido de un enjuague con agua destilada durante 3 minutos, y se lavan en tampón fosfato salino (llamado PBS) durante 5 minutos. </li><li> Las diapositivas se colocan en planos bastidores tinción estrecho llamado Sequenza (Shandon Sistema inmunotinción Sequenza de Thermo Scientific) y lavadas con PBS. </li><li> Las diapositivas se immunostained para ERCC1 o PMS2 se exponen a 10 minnutos de exposición a un tratamiento adicional de 3 gotas de una solución propietaria, obtenidos a partir de Biocare, llamado &quot;Sniper&quot;, que actúa para reducir la tinción no específica de las proteínas de fondo. </li><li> Los portas se lavan con un tampón &quot;TBST&quot;, que es de 1 ml de Tween + 100 ml de Tris 10x + 900 ml de agua destilada [10 veces en Tris es de 24.2 gramos Trizma + 80 gramos de NaCl + 1.000 ml de agua destilada y desionizada + HCl concentrado (aproximadamente 15 ml) para llevar la solución a pH 7,6]. </li><li> Portaobjetos se lavan tres veces con tampón y 100 microlitros de Dako con biotina anticuerpo secundario a la dilución 1:100 (en bovinos 2% de albúmina de suero compuesto en TBST buffer) se añaden a las diapositivas y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> En este punto, Vectastain ABC (avidina biotina) (de Vector Laboratories) reactivo se preparará, con 2,5 ml de PBS, una solución de baja A, 1 B solución de gota, y la solución se deja reposar durante 30 minutos. </li><li> Los portas se lavan 3 veces con tampón TBST. </li><li> Luego 3 gotas de reactivo Vectastain ABC se suma y las diapositivas se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos, seguido de un enjuague dos veces con TBST. </li><li> Las diapositivas se sumergen en DAB (diamino-benzamida) (2,9 ml DAB + 400 microlitros de PBS + 250 microlitros de peróxido de hidrógeno) durante unos 5 minutos. </li><li> Las diapositivas se enjuagan dos veces con agua destilada, desionizada. </li><li> Contratinción se realiza con una solución diluida de hematoxilina durante 10 segundos. Portas se lavan bien con agua corriente y después destilada. </li><li> Portaobjetos se deshidratan 2 veces durante 2 minutos en etanol al 95%, dos veces durante 2 minutos en etanol al 100% y 2 veces durante 2 minutos en xileno. </li><li> Un par de gotas de Cytoseal XYL (Richard Allan-científico) se añaden a las diapositivas y aplicar un cubreobjetos. </li><li> Evaluación inmunohistoquímica de ERCC1, Ku86 y CCOI se realizan utilizando el mismo protocolo que para PMS2, pero sustituyendo el anticuerpo con anticuerpos PMS2 de ERCC1, Ku86 y CCOI se describe en la siguiente tabla. </li></ol> La evaluación de las secciones de tejido de las criptas deficiencia en la expresión de ERCC1, PMS2, Ku86 y CCOI <ol><li> Vamos a ver por primera vez en secciones de tejido bajo un Motic (DM-BA300) fotomicroscopio para la expresión de PMS2 y ERCC1 en las criptas de la mucosa del colon. </li><li> PMS2 y ERCC1 son las enzimas de reparación del ADN, por lo que se encuentran en el ADN es, en los núcleos de las células de las criptas. Esto se indica en la Figura 1, donde los dos puntos que representan la tinción de color marrón ERCC1, se produce en el núcleo de las células en una cripta. La cripta normal, se muestra por primera vez en el microscopio estaba manchada de ERCC1, y la mancha marrón muestra la ubicación de ERCC1. Destacamos los tipos de células de las criptas, donde &quot;las células caliciformes&quot; son una forma similar a una copa de vino, con núcleos en una pequeña región en la base de las células en el borde exterior de la cripta, y un abombamiento sección, llena de gránulos de mucina blanco en la parte de la célula en el interior de la cripta. Los otros dos tipos de células tienen un aspecto un tanto igual en nuestras secciones de colores, y son los enterocitos y células enteroendocrinas, y sus núcleos también se encuentran en el borde exterior de la cripta, en la base de las células. En las biopsias tomadas de pacientes que nunca tuvieron una neoplasia de colon, o en las biopsias, lejos de cualquier sitio de cáncer de colon, la casi totalidad de los núcleos de todas las criptas muestran el nivel normal alto de expresión de ERCC1 como se muestra aquí. </li><li> Para orientar nuestras observaciones, las secciones de tejidos obtenidos a partir de biopsias de pacientes con neoplasia de colon no se observan los niveles de expresión de PMS2, ERCC1, CCOI Ku86 o en la mucosa colónica normal. Podemos observar todas las criptas en una sección de tejido normal, con una lente de objetivo de 40x, ya que poco a poco ir a través de una sección de tejido entero y señalar las criptas, las células intersticiales, los nódulos linfáticos en la diapositiva, y la capa muscular (si está presente en la biopsia). </li><li> También señalan que sólo hay varias células en la base de la cripta, que son las células madre. Estas células madre generan todos los cerca de 2.000 células de la cripta completa. Una célula madre con una mutación o un epimutation puede tomar el nicho de células madre todo. A continuación, la cripta todo puede haber alterado la tinción de una enzima de interés (conversión cripta) como se muestra en esta nueva diapositiva en la que vemos las criptas toda deficiencia de CCOI junto a las criptas que tienen una alta expresión de CCOI. </li><li> A continuación se muestra una diapositiva de un paciente con un cáncer de colon o un adenoma con neoplasia avanzada. En esta diapositiva, algunas criptas tienen un nivel normal alto de expresión de ERCC1 y algunos tienen niveles más bajos de expresión. Todas las criptas dentro de la sección de tejido son fotografiados en baja resolución con un lente objetivo de 10x, y las imágenes son de baldosas de modo que toda la sección de tejido se ve en una imagen. Las criptas se numeran. </li><li> Las criptas con alta expresión de la enzima, típico de las criptas en las biopsias de aquí para allá lejosm cualquier tipo de cáncer, se llaman nivel &quot;4&quot; manchas. Otros niveles son &quot;0&quot; si no hay una expresión detectable, &quot;1&quot; si la expresión apenas detectable es evidente, &quot;2&quot; si no está presente la expresión, pero a un nivel mucho más bajo que el nivel 4, y &quot;3&quot; si la expresión es presente en un nivel inferior a 4, pero bastante fuerte. Nos puntos cada diapositiva en el azul imágenes de baja resolución para 4, verde por 3, de color amarillo para dos, el naranja para 1 y el rojo para 0. Aquí mostramos pasando por una sección de una biopsia usando una lente de objetivo de 40x. Nos puntos de las criptas en la imagen de baja resolución. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Una cripta del colon mostrando una elevada expresión de ERCC1 en los núcleos de las células de las criptas. Todos los colores en esta imagen se han mejorado también en el contraste y la saturación, utilizando Paint Shop Pro 5. Resultados representante <ol><li> Las secciones de tejido alternativo en diapositivas separadas nos permite ver las criptas del colon misma, con expresión de dos proteínas diferentes se muestra mediante técnicas de inmunohistoquímica. La imagen de una cripta teñido de PMS2 y el manchado misma cripta de ERCC1 se muestra en los microscopios junto con los monitores de ordenador al lado. Esto nos permite determinar si hay deficiencia conjunta de dos proteínas, o si las deficiencias en cada una de las proteínas, mientras que cada uno es frecuente, se produce de forma independiente. Tenemos tres cortes de tejido en cada diapositiva, de modo que cualquier deficiencia evidente en la expresión de una proteína se puede verificar como deficiente en más de una sección, y no debido a un artefacto. En los tejidos circundantes cáncer de colon, donde hay un defecto en el campo dando lugar a que el cáncer, hay una alta frecuencia de las criptas deficiente de ERCC1 y PMS2. </li><li> También hemos utilizado técnicas de inmunohistoquímica para encontrar la frecuencia de las criptas deficiente para Ku86 y CCOI. En esta diapositiva, pasamos por una sección de tejido toda immunostained para Ku86, usando una lente de objetivo de 40x, y podemos ver que algunas criptas son deficientes para Ku86 en esta sección de tejido. </li><li> Del mismo modo, en esta diapositiva, pasamos por una sección de tejido toda immunostained para CCOI, usando una lente de objetivo de 40x, y podemos ver que sólo un número moderado de las criptas son deficientes para CCOI. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hydrophobic+bile+acids,+genomic+instability,+Darwinian+selection,+and+colon+carcinogenesis.">hydrophobic bile acids, genomic instability, Darwinian selection, and colon carcinogenesis.</a> Clinical and Experimental Gastroenterology. 1, 19-47 (2008).</li></ol>

<ol><li> Es muy importante contar con tres secciones de tejido en cada diapositiva. Burbujas puede ocurrir cuando la aplicación de los medios de comunicación que lleva el anticuerpo, por lo que algunas criptas o partes de las criptas no se puede teñir adecuadamente sólo por una burbuja de prevenir el anticuerpo reaccione con la sección de tejido. Las criptas son alrededor de 60 micras de diámetro, y las secciones de tejido de 4 micras de espesor, lo que podría haber hasta 15 secciones de tejido a través de la misma cripta. Por lo general es posible encontrar la misma cripta, con la morfología de la cripta como una guía, en secciones de tejido múltiples coloca en un portaobjetos. </li><li> En nuestros estudios recientes, de grandes muestras de tejido, la tinción en un Sequenza no puede dar cobertura anticuerpos buena nueva a los tejidos. En estos casos, uno puede preferir utilizar la mano de tinción de los tejidos, donde una gota de medio que contiene el anticuerpo es a mano se coloca sobre cada muestra de tejido. </li><li> Para ver claramente la coloración marrón que muestra la expresión de la proteína inmuno-, y la coloración azul que muestra de ADN nuclear en el monitor de la computadora, el software Motic fotomicroscopio se ajusta de la siguiente manera: Ganancia 0, la posición 0, Enhance 0, 255, Gamma 1.00, 0, Nitidez 1, corrección de color de 7, R, G, B Ganancia 1,00, y R, G, B 0 brillo. La resolución se ajusta a 1024 x 768, y el balance de blancos está habilitada. </li><li> Nuestro método podría ser utilizado con todas las proteínas que se consideran importantes en la progresión al cáncer de colon, para evaluar la frecuencia de la deficiencia, o posiblemente sobre-expresión, en los defectos del campo alrededor de los cánceres de colon o adenomas con neoplasia avanzada. </li><li> Defectos en el campo son una parte de la progresión a cáncer El término &quot;cancerización del campo&quot; fue utilizado por primera vez por Masacre et al. En 1953, una para describir un área o &quot;campo&quot; del epitelio que ha sido precondicionado por procesos en gran parte desconocida (en el momento) con el fin de que predisponen al desarrollo del cáncer. El uso inicial fue en el contexto de los cánceres orales. Desde entonces, los términos &quot;cancerización de campo&quot; y &quot;defectos en el campo&quot; se han utilizado más ampliamente para describir cualquier tejido pre-maligna en la que nuevos tipos de cáncer tienen más probabilidades de surgir, y el concepto de cancerización del campo de la oncología clínica ha recibido una atención creciente 2 . Recientemente hemos revisado la evidencia de los defectos del campo en el cáncer gastrointestinal 3. Incluidos en esta revisión fueron los resultados de una docena de estudios que demuestre que los defectos del campo en el colon. Defectos en el campo de la mucosa del colon, probablemente surgen por la selección natural de las células mutantes o células alteradas epigenéticamente entre las células madre de una cripta de tal manera que una célula madre sobrevive cuatro nichos de sucesión. Inestabilidad genética o de un fenotipo mutador, quizás debido a la reducción de la reparación por escisión de nucleótidos del ADN o de reparación del ADN no coincide, podría acelerar este proceso (y un defecto frecuente en PMS2 se había informado anteriormente en las áreas circundantes de cáncer de colon 5). Si, en una población normal de las células madre en la mucosa del colon, una célula adquiere una ventaja selectiva a través de una mutación o un epimutation, tenderá a expandirse clonalmente a expensas de las células madre vecinos. En la mucosa del colon, el nicho de células madre está ocupada por ≤ 5 6 células que luego dan lugar a todos (aproximadamente 2.000), las células de la cripta. Una toma de posesión del nicho de células madre por un resultado de tipo mutante o alterado epigenéticamente celular en la &quot;conversión cripta&quot; 7. La propagación de clones mutantes (criptas convertido) en el epitelio del colon puede ocurrir con mayor frecuencia por fisión cripta 8. Un ejemplo de la fisión cripta se muestra en la Figura 2. De esta manera, un parche de tejido anormal se presenta. Dentro de este parche, una mutación como segundo puede ocurrir de modo que adquiere una cripta dado una ventaja en comparación con otras criptas en el parche, y esta cripta se expandirse clonalmente formando una mancha secundaria en el parche original. Dentro de este nuevo parche, el proceso puede repetirse varias más tiempo, quizá durante décadas, hasta que una célula madre maligna que surge clonal se expande en un cáncer. Si este es el proceso general por el cual esporádicos adenocarcinomas de colon surgen, entonces adenocarcinomas de colon en general, deben estar asociados con, y estar precedidas por, los campos de la anormalidad. Así, un trozo de criptas convertidos se podría esperar que los defectos detectables en los alrededores de un adenoma con neoplasia avanzada, o alrededor de un cáncer de colon. A partir de este modelo de pre-progresión tumoral, uno esperaría encontrar alteraciones genéticas o epigenéticas relacionadas con la pre-progresión tumoral en las muestras de tejido tomadas de la mucosa del colon no neoplásicas en las áreas circundantes lesiones neoplásicas de colon que son propensos a desarrollar cáncer . En particular, los defectos en las enzimas de reparación del ADN o las proteínas necesarias para la apoptosis, que contribuyen a la progresión de la mejora de la inestabilidad genómica, y se podría esperar que se encuentra en un campo defectuoso. </li><li> Selección de deficiencia en PMS2 cuando las células son deficient de ERCC1 y sometidos a un agente que daña el ADN Nara et al. 9 crecieron 25 cultivos de células de ovario de hámster chino 43-3B, todas con una mutación inactivación del gen de reparación del ADN ERCC1, y trataron los cultivos con un agente que daña el ADN, MNNG. Entre las células supervivientes el tratamiento de daños en el ADN, de una sola célula fue aislado de cada cultura y les permita formar un clon. Todos los clones aislados fueron alrededor de 10 veces más resistente a la muerte por MNNG que la cepa parental. De los clones aislados, 22 se demostró que los defectos de reparación del ADN ADN (MMR). Cinco de estos 22 clones se analizaron por secuenciación, y tres de los cinco eran deficientes para PMS2. Esta selección por defecto en PMS2 fue probablemente debido a la deficiencia de PMS2 causado resistencia a la apoptosis, y por lo tanto la capacidad de sobrevivir a los daños en el ADN añadido que queda en las células cuando ERCC1 estaba ausente. (Normalmente, PMS2 sentidos los niveles de daño del ADN, y hace que las células a la apoptosis cuando el daño del ADN es excesivo.) Por lo tanto, una deficiencia en PMS2 se selecciona cuando ERCC1 déficit de las células son sometidas a daños en el ADN. Clones defectuosos tanto en ERCC1 y PMS2 demostraron tener una tasa de mutación de 500 a 1.000 veces mayor cuando es irradiado con UV que las células de los padres. </li><li> Los ácidos biliares causan el estrés oxidativo, son agentes que dañan el ADN y son importantes en la progresión al cáncer de colon Ácido desoxicólico, un ácido biliar, aumenta el estrés oxidativo a través de la generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) por varios procesos, incluyendo daño de las mitocondrias 10. Existe evidencia reciente de que ROS causar cambios epigenéticos 11, y por lo menos 15 estudios han demostrado que los ácidos biliares, en el aumento de las concentraciones que acompaña con una dieta alta en grasas, causa daño en el ADN 12. Tal como fue revisado por Bernstein et al. 12, hay una asociación positiva entre el consumo de grasa en la dieta y la incidencia de cáncer de colon. Los ácidos biliares son secretados en el tracto intestinal en respuesta a la grasa en la dieta, y los ácidos biliares actúan como detergentes para ayudar en la digestión de las grasas. Por lo tanto, una dieta alta en grasa se asocia con aumento de la secreción de ácidos biliares. Concentraciones fecales de ácidos biliares se encuentran elevados en poblaciones con una alta incidencia de cáncer de colon, y la excesiva exposición a los ácidos biliares es considerado como un factor de riesgo importante para la carcinogénesis de colon 13. Los ácidos biliares pueden ser causa de defectos en el campo en el colon. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. A fisión cripta del colon en tres criptas. Conclusión Se encontró una alta frecuencia de las criptas deficientes en los genes de reparación del ADN ERCC1 y PMS2 (PMS2 también es necesaria para la apoptosis) en los defectos del campo que rodea el cáncer de colon. Las deficiencias en ERCC1 y PMS2 (debido a los cambios epigenéticos o mutaciones) pueden ser los primeros pasos en la inestabilidad genética fundamental para la progresión a cáncer de colon.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PMS2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>556415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ERCC1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>MS-671-P1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ku86 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotech.</td>
<td>SC-9034</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CcO1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>459600</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated secondary</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DAKO</td>
<td>E0413</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22% BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Informagen, Inc.</td>
<td>2327</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sniper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biocare Medical</td>
<td>BS966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectastain ABC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Labs</td>
<td>PK-6100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>34001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>20605</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytoseal XYL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48212-196</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>Trizma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
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deficient pms2, ercc1, ku86, ccoi in field defects during progression to colon cancer

En la carcinogénesis, el &quot;defecto de campo&quot; se reconoce clínicamente debido a la alta propensión de los sobrevivientes de ciertos tipos de cáncer para desarrollar otros tumores malignos del mismo tipo de tejido, a menudo en las inmediaciones. Estos defectos de campo se han indicado en el cáncer de colon. Las alteraciones moleculares que son responsables de un defecto del campo en el colon debe ser detectable en alta frecuencia en el tejido histológicamente normal alrededor de un adenocarcinoma de colon o alrededor de un adenoma con neoplasia avanzada (en el buen camino a un cáncer de colon), pero a baja frecuencia en la mucosa del colon de los pacientes sin neoplasia de colon. Mediante inmunohistoquímica, criptas todo dentro de los 10 cm a cada lado de los adenocarcinomas de colon o de neoplasias de colon avanzado se encontró que con frecuencia reducida o ausente en la expresión de dos proteínas de reparación del ADN, PMS2 y / o ERCC1. PMS2 es una proteína de función dual, activo en la reparación del ADN no coincide, así como es necesario en la apoptosis de las células con daño en el ADN en exceso. ERCC1 está activo en la reparación del ADN por escisión de nucleótidos. La expresión reducida o ausente de los dos ERCC1 y PMS2 crearía las células con mayor capacidad de ambos para sobrevivir (resistencia a la apoptosis) y aumento del nivel de la mutabilidad. La expresión reducida o ausente de los dos ERCC1 y PMS2 es probable que un primer paso en la progresión del cáncer de colon. Gen de reparación del ADN Ku86 (activo en el ADN de extremos no homólogos de unión) y Citocromo c oxidasa I (implicados en la apoptosis) tenían cada uno ha informado de que se redujo en la expresión en áreas cerca de la mucosa del colon. Sin embargo, la evaluación inmunohistoquímica de sus niveles de expresión mostró que sólo baja a las frecuencias modesta de las criptas a ser deficiente en su expresión en un defecto del campo que rodea el cáncer de colon o alrededor de la neoplasia de colon avanzado. Mostramos aquí, nuestro método de evaluación de las criptas de la expresión de ERCC1, PMS2, Ku86 y CCOI. Se demuestra que la frecuencia de las criptas toda deficiencia de PMS2 y ERCC1 es a menudo tan grande como 70% a 95% en 20 cm de largo las áreas alrededor de una neoplasia de colon, mientras que la frecuencia de las criptas deficiente en Ku86 tiene un valor promedio de 2% y la frecuencia de las criptas deficiente en CCOI tiene un valor promedio de 16% en estas áreas. Todo el colon es de 150 cm de largo (cerca de 5 pies) y tiene unos 10 millones de criptas en su capa de la mucosa. El defecto en PMS2 y ERCC1 alrededor de un cáncer de colon puede incluir por tanto 1.000.000 criptas. Es a partir de una cripta defectuoso que el cáncer de colon se presenta.

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Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

Reducción de la expresión / ausente de PMS2 y / o ERCC1 en las criptas todo es un evento frecuente dentro de los 10 cm a cada lado de los adenocarcinomas de colon, probablemente la base de un defecto en el campo con gran capacidad de mutar y progresión del cáncer. La deficiencia en Ku86 o CCOI es mucho menos frecuente en estos defectos en el campo.

PMS2 deficiente, ERCC1, Ku86, CCOI en los defectos del campo durante la progresión de cáncer de colon

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other ...

deficient-pms2-ercc1-ku86-ccoi-field-defects-during-progression-to

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K vistas.  University of Arizona, Tucson. Reducción de la expresión / ausente de PMS2 y / o ERCC1 en las criptas todo es un evento frecuente dentro de los 10 cm a cada lado de los adenocarcinomas de colon, probablemente la base de un defecto en el campo con gran capacidad de mutar y progresión del cáncer. La deficiencia en Ku86 o CCOI es mucho menos frecuente en estos defectos en el campo.

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Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and functional tissue. Matrix associated stem cell implants (MASI) aim to regenerate cartilage defects due to arthritic or traumatic joint injuries. Adult mesenchymal stem cells (MSCs) have the ability to differentiate into cells of the chondrogenic lineage and have shown promising results for cell-based articular cartilage repair technologies. Autologous MSCs can be isolated from a variety of tissues, can be expanded in cell cultures without losing their differentiation potential, and have demonstrated chondrogenic differentiation in vitro and in vivo1, 2.
In order to provide local retention and viability of transplanted MSCs in cartilage defects, a scaffold is needed, which also supports subsequent differentiation and proliferation. The architecture of the scaffold guides tissue formation and permits the extracellular matrix, produced by the stem cells, to expand. Previous investigations have shown that a 2% agarose scaffold may support the development of stable hyaline cartilage and does not induce immune responses3.
Long term retention of transplanted stem cells in MASI is critical for cartilage regeneration. Labeling of MSCs with iron oxide nanoparticles allows for long-term in vivo tracking with non-invasive MR imaging techniques4.
This presentation will demonstrate techniques for labeling MSCs with iron oxide nanoparticles, the generation of cell-agarose constructs and implantation of these constructs into cartilage defects. The labeled constructs can be tracked non-invasively with MR-Imaging.

Goal of the presentation is to demonstrate a highly reproducible method to generate matrix associated stem cell implants in cartilage defects, which can be visualized with MR imaging. Stem cells are labeled with FDA-approved Ferumoxides, mixed with agarose, implanted into cartilage defects and imaged with a 7T MR scanner.

Implantación de Ferumoxides Etiquetada células madre mesenquimales humanas en los defectos del cartílago

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Investigación

Biología

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given physical activity. Although some sports are relatively easy to be reproduced in a laboratory (e.g., running and cycling), a number of sports are much more difficult to be reproduced and studied in controlled situations. This method presents how to assess the differential contribution of the energy systems in sports that are difficult to mimic in controlled laboratory conditions. The concepts shown here can be adapted to virtually any sport.
The following physiologic variables will be needed: rest oxygen consumption, exercise oxygen consumption, post-exercise oxygen consumption, rest plasma lactate concentration and post-exercise plasma peak lactate. To calculate the contribution of the aerobic metabolism, you will need the oxygen consumption at rest and during the exercise. By using the trapezoidal method, calculate the area under the curve of oxygen consumption during exercise, subtracting the area corresponding to the rest oxygen consumption. To calculate the contribution of the alactic anaerobic metabolism, the post-exercise oxygen consumption curve has to be adjusted to a mono or a bi-exponential model (chosen by the one that best fits). Then, use the terms of the fitted equation to calculate anaerobic alactic metabolism, as follows: ATP-CP metabolism = A1 (mL . s-1) x t1 (s). Finally, to calculate the contribution of the lactic anaerobic system, multiply peak plasma lactate by 3 and by the athlete&#x2019;s body mass (the result in mL is then converted to L and into kJ).
The method can be used for both continuous and intermittent exercise. This is a very interesting approach as it can be adapted to exercises and sports that are difficult to be mimicked in controlled environments. Also, this is the only available method capable of distinguishing the contribution of three different energy systems. Thus, the method allows the study of sports with great similarity to real situations, providing desirable ecological validity to the study.

This protocol allows researchers focused on exercise and sports sciences to determine the relative contribution of three different energy systems to the total energy expenditure during a large variety of exercises.

Determinación de la Contribución de los Sistemas de energía durante el ejercicio

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

El análisis genético rápido de epitelio-mesenquimal de señalización durante la regeneración del cabello

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Medición de fuerza durante la contracción para evaluar la función muscular en larvas de pez cebra

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Aislamiento de Miofibroblastos primarias de ratón y el tejido del colon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Detección de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal de transición

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

Seguimiento temporal de la progresión del ciclo celular El uso de citometría de flujo sin la necesidad de sincronización

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual inflammation, progressive destruction and regeneration of the hepatic parenchyma, liver progenitor cell proliferation, and fibrosis. The end-stage of every chronic liver disease is cirrhosis, a major risk factor for the development of hepatocellular carcinoma. To study processes regulating disease initiation, establishment, and progression, several animal models are used in laboratories. Here we describe a six-week time course of the choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) mouse model, which involves feeding six-week old male C57BL/6J mice with choline-deficient chow and 0.15% DL-ethionine-supplemented drinking water. Monitoring of animal health and a typical body weight loss curve are explained. The protocol demonstrates the gross examination of a CDE-treated liver and blood collection by cardiac puncture for subsequent serum analyses. Next, the liver perfusion technique and collection of different hepatic lobes for standard evaluations are shown, including liver histology assessments by hematoxylin and eosin or Sirius Red stainings, immunofluorescent detection of hepatic cell populations as well as transcriptome profiling of the liver microenvironment. This mouse model is suitable for studying inflammatory, fibrogenic, and liver progenitor cell dynamics induced through chronic liver disease and can be used to test potential therapeutic agents that may modulate these processes.

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented CDE Diet Model of Chronic Liver Injury

Here we describe a common method to induce chronic liver injury in mice by feeding of a choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) diet. We demonstrate health monitoring, liver perfusion, isolation, and preservation. A time course of six weeks can inform about liver injury, pathohistology, fibrosis, inflammatory, and liver progenitor cell responses.

El murino colina deficientes, suplementada con Ethionine (CDE) dieta de modelo de la lesión hepática crónica

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual ...

Assessing Urinary Tract Junction Obstruction Defects by Methylene Blue Dye Injection

Urinary tract junction obstruction defects are congenital anomalies inducing hydronephrosis and hydroureter. Murine urinary tract junction obstruction defects can be assessed by tracking methylene blue dye flow within the urinary system. Methylene blue dye is injected into the renal pelvis of perinatal embryonic kidneys and dye flow is monitored from the renal pelvis of the kidney through the ureter and into the bladder lumen after applying hydrostatic pressure. Dye accumulation will be evident in the bladder lumen of the normal perinatal urinary tract, but will be constrained between the renal pelvis and the end point of an abnormal ureter, if urinary tract obstructions occur. This method facilitates the confirmation of urinary tract junction obstructions and visualization of hydronephrosis and hydroureter. This manuscript describes a protocol for methylene blue dye injection into the renal pelvis to confirm urinary tract junction obstructions.

Methylene blue dye injection into the renal pelvis facilitates the assessment of urinary tract junction obstruction defects during mouse embryonic urinary tract development. Here, a protocol for methylene blue dye injection into the renal pelvis is described.

Evaluación defectos de obstrucción urinaria cruce por la inyección de tinte de azul de metileno

Urinary tract junction obstruction defects are congenital anomalies inducing hydronephrosis and hydroureter. Murine urinary tract junction obstruction ...