Este método permite detectar, mediante un enfoque no invasivo, al paciente con lesión neoplásica colorrectal. En particular, esta prueba permite, en asociación con las pruebas utilizadas actualmente en el programa de detección del cáncer colorrectal, para predecir mejor la presencia de cáncer o mayor riesgo de lesiones anormales. Para comenzar este protocolo, centrifugar una alícuota de cada control positivo, ADN estándar y ADN puntiagudo, en un formato seco durante 10 segundos en una mini centrífuga.
Resuspender el control positivo con 750 microlitros de agua. Resuspender el ADN de espiga, utilizado como un control interno exógeno, para probar la presencia de inhibidores, con 100 microlitros de agua. Para la curva estándar, resuspender el estándar seco con 100 microlitros de agua y hacer cuatro diluciones 1:5 a partir de la solución de stock.
Luego, vórtice cuidadosamente los reactivos durante 15 segundos, y centrifugar en una mini centrífuga durante 10 segundos. Para una resuspensión completa, almacene los reactivos líquidos a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de usarlos. Para preparar el control de ADN de 1x pico, mezcle cinco microlitros de pico de FL-DNA con 45 microlitros de agua estéril.
Para las muestras, mezcle 75 microlitros de cada muestra con 50 microlitros de ADN de 1x espiga, produciendo un volumen total de 125 microlitros. En primer lugar, abra el software operativo qPCR. Para configurar la placa, establezca el Tipo de pozo para las ocho posiciones en la columna uno, como Estándar.
Establezca el Tipo de pozo para los pozos A2 y B2 como NTC. Establezca el Tipo de pozo para los controles positivos, C2 y D2, como Desconocido. Y establezca el Tipo de pozo para todas las demás posiciones como Desconocido.
Seleccione las 96 posiciones. Agregue los tintes, FAM y HEX y haga clic en Sincronizar placa. A continuación, establezca el perfil térmico, según lo dispuesto.
Preparar el número deseado de tiras de 8 pocódicos que contienen mezclas completas de amplificación liofilizada, con imprimaciones y sondas específicas dirigidas al ADN humano, y el control interno. Para llevar el contenido a la parte inferior de los tubos, centrifugar las tiras durante 10 segundos. Retire suavemente los sellos de las tiras, asegurándose de no perder ningún pellet.
A continuación, agregue 25 microlitros de agua a los pozos de control negativos. 25 microlitros de ADN de muestra para muestrear pozos y 25 microlitros de ADN de control positivo a los pozos de control positivo. Para la curva estándar, agregue 25 microlitros de estándar 1, 2, 3 y 4 en cada pozo dedicado.
Utilice tapas ópticas planas de 8 tiras para cerrar cuidadosamente todas las tiras y el vórtice durante unos segundos. Centrifugar las tiras durante 10 segundos, cargarlas en el instrumento e iniciar la carrera. Al final de la ejecución, para FAM FL-DNA A y HEX IC, seleccione columnas, A, C, E y G.Para FAM FL-DNA B y HEX IC, seleccione columnas, B, D, F y H.Para la cantidad inicial de cantidades estándar, establezca 10 nanogramos por reacción para pozos A1 y B1, dos nanogramas por reacción para C1 y D1 punto cuatro nanogramos por reacción , y el punto cero ocho nanogramos por reacción para G1 y H1. A continuación, para los canales FAM y HEX, establezca los valores de fluorescencia de umbral en 150.
En el cuadro Tabla de resultados, haga clic en Opciones de columna, luego, Seleccionar todo y, a continuación, Aceptar, para obtener los resultados en ambos canales con sus respectivos valores Cq y delta R, que son suministrados por el software de instrumentos qPCR en tiempo real. Delta R corresponde al valor de fluorescencia normalizado al último ciclo de amplificación. En el cuadro Tabla de resultados, haga clic con el botón derecho en la tabla para abrir el menú contextual.
Haga clic en Enviar a Excel para exportar los datos sin procesar. Y luego cargue el archivo de Excel en el software de análisis dedicado para el cálculo automatizado de la cantidad de FL-DNA. A partir de la combinación de valores iFOBT y FL-DNA estimados para cada paciente, el riesgo de cáncer colorrectal.
Las curvas de fluorescencia de una muestra positiva adecuada muestran la señal de muestra en el canal HEX, que es el control interno, dentro del rango aceptable. La señal positiva está por encima del umbral en el canal FAM, que muestra la amplificación de los genes diana. Las curvas de fluorescencia de una muestra negativa adecuada muestran la señal de muestra dentro del rango aceptable en el canal HEX.
La señal de control negativa está por debajo del umbral en el canal FAM. Por otro lado, las curvas de una muestra no adecuada muestran la señal de muestra que no está dentro del rango aceptable en el canal HEX. Lo más probable es que se deba a una posible inhibición.
Por lo tanto, esta muestra debe repetirse, a partir de la extracción. La tabla de resultados de análisis de software muestra datos para Mix A y Mix B en términos de concentración de FL-DNA para controles de reacción, muestras clínicas y resultados de control de calidad de ejecución. El número de muestra cuatro no tiene ningún resultado porque no pasó el control de calidad.
Debe repetirse y volver a analizarse. Tenga cuidado cuando resusppended el ADN para el spike-in control a la curva estándar. Y al distribuir diferentes DNAs a tiras de 8 pozos, así como durante la detección molecular en la sección de análisis de resultados.
Este método debe realizarse en combinación con la prueba iFOBT para permitir una mejor evaluación de las lesiones neoplásicas colorrectales, debe llevarse a cabo con la misma muestra fecal.
