Reconocemos la ayuda proporcionada por Lourdes Delta Arrueta Antequera (Departamento de Entomología, Universidad Estatal de Ohio / OARDC, Wooster, OH) en la configuración de los experimentos. Agradecemos a la Dra. Teresa Polonia (USDA, Servicios Forestales, NRS) para enviar muestras de larvas de EAB. Ayuda proporcionada por el Dr. Luis A. Cañas y Nuris M Acosta con la configuración de microscopio se aprecia. La financiación de este proyecto fue proporcionado por fondos estatales y federales asignados a la Ohio Investigación y Desarrollo Agrícola del Centro, The Ohio State University.

El protocolo completo con las diferentes etapas se ilustra en el diagrama de flujo en la Figura 1. Medidas individuales que constituyen la disección, extracción de ARN, la síntesis de cDNA primer lugar y QRT-PCR se detallan a continuación. I. La disección de larvas <ol><li> Antes del inicio de este procedimiento, el lugar barrenador esmeralda del fresno, o BEF, las larvas de un pañuelo de papel húmedo hasta que se llevan a cabo disecciones. Mantenga fresco fosfato preparado 1X solución salina tamponada, o PBS, en el hielo para mantener frío el buffer a través de la disección. </li><li> Para empezar, fijar las larvas de EAB en la placa de la disección con alfileres la disección fina. A continuación, agregue frío PBS 1X a la placa de disección. </li><li> En primer lugar, decapitar a las larvas con un buen par de tijeras de disección. Posteriormente eliminar el último segmento abdominal de las larvas. </li><li> Con un par de pinzas de relojero, levantar la cutícula de la canal, las larvas. Luego, hacer una incisión a lo largo de la longitud de la carcasa con un par de tijeras. Tenga cuidado de no romper la tripa como la incisión se hace. </li><li> Cuidadosamente aislar el tejido del intestino medio de otros tejidos como los órganos de grasa y tejido conectivo. Luego, enjuague el tejido fresco en tampón PBS 1X para asegurarse de que no hay contaminación de fatbody. Transferir el intestino aislado a 500 l de pre-enfriado reactivo Trizol en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> A continuación, aislar el tejido de grasa corporal el uso de fórceps y transferirlo a un tubo Eppendorf de 1,5 ml que contiene 500 l de reactivo Trizol refrigerados. </li><li> Por último, aislar el tejido cutícula de la carcasa de larvas en un desguace de los tejidos adheridos, teniendo cuidado de no dañar la integridad del tejido. Enjuague el tejido cutícula aisladas en fresco tampón PBS y transferirlo a un tubo Eppendorf de 1,5 ml con 500 l de reactivo Trizol refrigerados. </li><li> Los tejidos aislados de grasa corporal, la cutícula y el intestino medio pueden ser almacenadas a -80 ° C hasta la extracción de RNA. </li><li> En preparación para la extracción de ARN, más o menos las muestras de EAB diferentes de acuerdo a las etapas de desarrollo. Estas etapas incluyen primero, segundo, tercero, y cuarto, estadios, prepupas y adultos. </li></ol> II. La extracción de RNA (como el protocolo del fabricante por s para el uso del reactivo Trizol) Homogeneización <ol><li> Para comenzar la extracción del ARN, utiliza por primera vez morteros de plástico a fin de homogeneizar los tejidos del Trizol con tubos Eppendorf de 1,5 ml. Después de la homogeneización, un volumen total de cada ml de muestra a 1 con el reactivo Trizol. </li><li> Para las etapas de desarrollo, homogeneizar animal entero en nitrógeno líquido con un mortero. A continuación, agregar una alícuota del homogeneizado (50 mg) a 1 ml de Trizol. </li></ol> De separación de fases: <ol start="3"><li> Incubar los tubos de muestra con 1 ml de Trizol durante 15 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Después de la incubación, añadir 200μL de cloroformo a cada tubo. Inmediatamente después de la adición de cloroformo, agitar los tubos vigorosamente durante 15 segundos. A continuación, se incuban los tubos a temperatura ambiente durante 2-3 minutos. </li><li> A continuación, centrifugar las muestras a 12.000 xg durante 15 minutos a 2 ° C. Después de la centrifugación, el ARN estará en la fase acuosa. El volumen de la fase acuosa debe ser de 600 l, o el 60% del volumen total de Trizol. </li></ol> ARN precipitación <ol start="6"><li> Retire con cuidado sólo la fase acuosa. Presencia de sustancias por debajo de la fase acuosa se produzca una contaminación de la ARN extraído. Entonces, la transferencia de la fase acuosa a un tubo debidamente etiquetado eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Para precipitar el ARN de la fase acuosa, la mezcla 0,5 ml de alcohol isopropílico para cada tubo. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la incubación, los tubos de centrifugación a 12.000 xg durante 10 minutos a 2 ° C. </li></ol> Lave ARN <ol start="8"><li> Tras la centrifugación, descartar el sobrenadante de los tubos. ARN está presente en la pastilla de gel formado en la parte inferior del tubo. Lavar el sedimento con etanol 75%, añadiendo al menos 1 ml de etanol al 75% por cada 1 ml de Trizol. Mezclar mediante agitación. A continuación, centrifugar los tubos a 7500Xg durante 5 minutos a 2 ° C. </li></ol> ARN de elución <ol start="9"><li> Descartar el sobrenadante de los tubos. Centrifugar los tubos de nuevo en la centrífuga pequeña mesa durante 1 minuto. Elimine cualquier exceso de sobrenadante del tubo con la pipeta con cuidado. Dejar el tubo abierto y que el aire de pellets secos durante 5-10 minutos. Tenga cuidado de no secar el pellet ya que esto disminuirá significativamente su solubilidad. </li><li> Después de secado al aire, resuspender el precipitado en <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Diethylpyrocarbonate">dietilpirocarbonato</a> o DEPC, el agua tratada. La cantidad de agua que se utiliza para volver a suspender el pellet dependerá del tamaño de la pastilla. Utilice 50 l de agua DEPC tratada por un smtodos l pellet o 100 para una pastilla grande. Deje que la pastilla se disuelve por completo en el agua tratada DEPC moviendo la punta de la pipeta hacia arriba y abajo varias veces. </li><li> Una vez que la pastilla se haya disuelto, coloque la muestra a 55 ° C durante 10 minutos. </li><li> A continuación, medir la concentración de cada muestra de ARN utilizando un espectrofotómetro Nanodrop (2 l de la muestra de ARN). </li><li> Almacenar las muestras de ARN a -80 ° C hasta su uso posterior. </li></ol> III. Primer capítulo de cDNA de síntesis (como el protocolo del fabricante por s utilizando superíndices botiquín de primeros capítulo de síntesis de Invitrogen.) <ol><li> Para cada muestra de ARN añadir lo siguiente en un tubo de PCR: <table border="0"><tbody><tr><td> ARN </td><td> x l </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP mix M </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> Oligo (dT) (0,5 mg / l) </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> DEPC agua tratada </td><td> (8-x) l </td></tr><tr><td> Volumen total: </td><td> 10 l </td></tr><tr><td colspan="2"> Nota: x es el volumen de ARN utilizado para la síntesis de cDNA. Dependiendo de la concentración de la ARN, 2.3 g de ARN se utiliza para cada reacción y el volumen total de cada reacción debe ser de 10 l. </td></tr></tbody></table></li><li> Coloque la mezcla de reacción anterior en un termociclador a 65 ° C durante 4 minutos. </li><li> Retire los tubos de la theromocyler y colocarlos en hielo inmediatamente a por lo menos 2 minutos. </li><li> Preparar el primer capítulo de la mezcla maestra, añadiendo lo siguiente: <table border="0"><tbody><tr><td> 10X Buffer RT </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> 25 mM de MgCl 2 </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> 0,1 M TDT </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> RNasa a cabo </td><td> 1 l </td></tr></tbody></table></li><li> Añadir 9 l de mezcla maestra a cada tubo con la muestra de ARN, mezclar por pipeteado y centrifugar brevemente la mezcla. </li><li> Coloque los tubos de nuevo en el termociclador e incubar durante 2 minutos a 42 ° C. </li><li> Pausa en el termociclador y añadir 1 l de superíndice II enzima transcriptasa inversa (Invitrogen) a cada tubo. Este paso se debe hacer rápidamente. </li><li> Incubar las muestras a 42 ° C durante 1,5 horas. </li><li> Terminar la reacción a 70 ° C durante 15 minutos. </li><li> Retire los tubos del termociclador y colocarlos en hielo. </li><li> Añadir 1 l de RNasa H a cada tubo y coloque de nuevo en el termociclador a 37 ° C durante 20 minutos. </li><li> Después de tomar las muestras del termociclador, se añaden 20 l de agua libre de nucleasa en cada tubo. El volumen de cada muestra se duplica en esta etapa. </li><li> Comprobar la concentración de cada muestra mediante el uso de 2 l de la muestra. Tomar alícuota de cada muestra, para que la concentración de 20ng/μl para su uso en QRT-PCR. La cantidad de agua que conforman las muestras a una concentración de 20ng/μl dependerá de la concentración inicial del cDNA sintetizado. </li></ol> IV. QRT-PCR: Primer diseño y determinación del gen de referencia <ol><li> Cartillas de diseño con una temperatura de fusión (Tm) de 60 ° C y un tamaño de producto de 100 pb ~. </li><li> AP-PERI1 se utiliza como el gen de interés para este experimento. Un gen de referencia o de control interno es necesaria para su posterior análisis y la normalización de los datos. Proteína ribosomal (AP-RP1) se utiliza como gen de referencia para este experimento. </li><li> Prepare 5um acciones de trabajo de los cebadores que se utilizarán, incluyendo el gen de referencia. </li></ol> Preparación de las normas <ol start="4"><li> Con el fin de calcular la eficiencia de los cebadores utilizados normas debe hacerse. </li><li> Haga una mezcla de cDNA a partir de las diferentes muestras que se probarán. </li><li> Hacer diluciones seriadas 5 veces para cada punto deseado en el gráfico. Cuatro diluciones debe ser suficiente, pero cinco son muy recomendables. </li><li> El volumen puede variar dependiendo de la cantidad de puntos y el número de repeticiones técnica se están utilizando. No debería ser suficiente para hacer una norma para cada gen se está probando que incluye el gen de referencia. </li></ol> Placa de plantilla <ol start="8"><li> Diseño de una plantilla que indica el nombre de la muestra para cada pozo de la placa de QRT-PCR. Recuerde que debe incluir normas para cada gen y por lo menos dos técnicos repeticiones por muestra. </li></ol> Configurar los parámetros de ciclismo <ol start="9"><li> Apague la máquina QRT-PCR y entre en los parámetros de la bicicleta. Los parámetros de los ciclos para este experimento es el siguiente: Paso 1: <ul><li> 1 ciclo: 95 ° C 3 minutos </li></ul> Paso 2: <ul><li> 40 ciclos: 95 ° C 15 segundos seguido de 60 ° C 30 seg (Opcional: para la determinación de la curva de fusión de las siguientes etapas) </li></ul&gt; Paso 3: <ul><li> 1 ciclo: 95 ° C 1 min </li></ul> Paso 4: <ul><li> 1cycle: 55 ° C 1 min </li></ul> Paso 5: <ul><li> 81 ciclos: 55 ° C 30 seg </li></ul></li></ol> Plato preparado para CFX96 (BioRad) de la máquina <ol start="11"><li> Prepare la mezcla maestra para cada gen (que incluye el gen de referencia) en el tubo por separado. Para cada bien, la mezcla maestra se compone de <table border="0"><tbody><tr><td> Nucleasa agua libre </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> 2,5 X SYBR verde </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> Cebador directo </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> Cebador inverso </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> Volumen total </td><td> L 8 </td></tr></tbody></table></li><li> Durante la preparación de la mezcla maestra incluyen 1-2 reacciones adicionales para dar cuenta de los errores de pipeteo. </li><li> De acuerdo con la plantilla previamente diseñada, añadir 2 l (20 ng / mL) de cDNA a cada pocillo. A continuación, agregue 8 l de la mezcla maestra para cada pozo, lo que resulta en un volumen total de 10 l por reacción. </li><li> Pipeta de arriba a abajo (2-3x) para asegurarse de que la muestra esté bien mezclado. Compruebe que el líquido no se mantiene en la punta. Para evitar la contaminación cruzada, use una punta nueva para cada muestra. </li><li> Una vez que toda la placa está configurada, cubrir la placa con cinta óptica. Evite tocar la cinta como la presencia de grasa puede afectar la lectura. A continuación, se centrifuga la placa a 500 rpm durante 1 minuto para asegurar que todos los productos de los pozos se encuentran en la parte inferior de la placa. </li><li> Después de la centrifugación, compruebe que no hay hielo o agua en la parte inferior de la placa. Por último, coloque la placa en la máquina de QRT-PCR y ejecutar el programa de PCR. </li></ol> V. Representación esquemática del experimento <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Diagrama de flujo que representa el orden secuencial de los pasos para el estudio de la expresión génica. <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: A) las larvas de EAB disección del intestino medio que muestra en el centro. B) aislados del intestino medio de larvas de EAB <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: A) Los valores medios de expresión relativa (revoluciones) de un gen peritrophin (AP-PERI1) en diferentes tejidos incluyendo la cutícula larval (Cu), intestino medio (MG) ​​y cuerpos grasos (FB). Un EAB específicas proteína ribosomal (en adelante llamado, AP-RP1) se utilizó como control interno para la normalización de los datos obtenidos para el gen de interés, AP-PERI1. B) Cambio relativo pliegue de la AP-PERI1 en los tejidos de las larvas. El tejido de la cutícula mostró la menor expresión y por lo tanto, se tomó como el calibrador (1X) de la muestra (Pfaffl, 2001). <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4: A) Los valores medios de expresión relativa (revoluciones) de un gen peritrophin (AP-PERI1) en diferentes etapas de desarrollo de esta plaga incluyendo estadios larvales (1 º, 2 º, 3 º y 4 º), prepupas (PP) y adultos (A). Una proteína específica EAB ribosomal (AP-RP1) se utilizó como control interno para la normalización de los datos obtenidos para el gen de interés, AP-PERI1. B) Cambio relativo pliegue de la AP-PERI1 en diferentes etapas de desarrollo. La muestra de PP mostró el menor nivel de los niveles de ARNm y por lo tanto se tomó como el calibrador (1X de la muestra). VI. Conclusión Cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) es una herramienta eficaz para el diagnóstico de los niveles de mRNA en tejidos de insectos y diferentes etapas de desarrollo. Además, QRT-PCR ha sido principalmente la herramienta clave para validar los datos generados a partir de análisis de alto rendimiento expresión génica como los microarrays y la nueva generación de ARN Seq-.

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	<li>Lehane, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritrophic+matrix+structure+and+function.">Peritrophic matrix structure and function.</a> Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).</li><li>Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cDNA+cloning+and+transcriptional+expression+of+a+peritrophin-like+gene+in+the+Hessian+fly,+Mayetiola+destructor+[Say].">cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say].</a> Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).</li><li>Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+of+the+midgut+transcriptome+of+the+poplar+leaf+beetle+Chrysomela+tremulae+reveals+new+gene+families+in+Coleoptera.+Ins+Bio+and+Mol.">Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol.</a> 39, 403-413 (2009).</li><li>Pfaffl, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR.">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).</li><li>Tellam, R. L., Lehane, M. J., Billingsley, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of the Insect Midgut. , 86-114 (1996).</li></ol>

Los ciclos de umbral (Ct) se obtiene el valor de cada muestra en la placa de QRT-PCR. Para la toma de la curva estándar, el valor de Ct obtenidos para cada dilución se traza contra el registro de su concentración. Los valores de Ct de las muestras experimentales se trazaron en esta curva de dilución estándar de la serie. Cantidades de destino se calcula a partir de separar las curvas de calibración generadas para cada tejido es decir, la experimentación y expresión del desarrollo. Los valores relativos de expres...

analysis of gene expression in emerald ash borer (agrilus planipennis) using quantitative real time-pcr

Barrenador esmeralda del fresno (EAB,<em&gt; Agrilus planipennis</em&gt;) Es una plaga exótica invasiva, que ha matado millones de fresnos (<em&gt; Fraxinus</em&gt; Spp) en América del Norte.<strong&gt;</strong&gt; EAB continúa propagándose con rapidez y los ataques de cenizas árboles de diferentes edades, a partir de árboles jóvenes de los árboles maduros. Sin embargo, hasta la fecha muy poco o ningún conocimiento molecular existe para EAB. Estamos interesados ​​en descifrar los procesos fisiológicos de base molecular a nivel de tejido que ayuda EAB en la colonización exitosa de los fresnos. En este informe se muestra el uso eficaz de indicadores cuantitativos PCR en tiempo real (QRT-PCR) para determinar los niveles de ARNm en diferentes tejidos larvarios (incluido el intestino medio cuerpo, la grasa y la cutícula) y las diferentes etapas de desarrollo (incluido un<sup&gt; St</sup&gt; -, 2<sup&gt; Nd</sup&gt; -, 3<sup&gt; Rd</sup&gt; -, 4<sup&gt; °</sup&gt;-Estadios, prepupas y adultos) de esta plaga. A modo de ejemplo, un gen peritrophin (aquí nombrados,<em&gt; AP-PERI1</em&gt;) Se ejemplifica como el gen de interés y una proteína ribosomal (<em&gt; AP-RP1</em&gt;) Como el control interno. Peritrophins son componentes importantes de la membrana peritrófica / matriz (PM), que es el revestimiento del intestino del insecto. La PM tiene diversas funciones como la digestión y la protección mecánica del epitelio del intestino medio.

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Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) es una herramienta eficaz para el diagnóstico de los niveles de mRNA en tejidos de insectos y diferentes etapas de desarrollo. En este informe se muestra el uso de QRT-PCR para determinar los niveles de ARNm en diferentes tejidos y estadios de desarrollo larvario de las especies de insectos invasores, el barrenador esmeralda del fresno.

Análisis de la expresión génica en el barrenador esmeralda del fresno ( Agrilus planipennis) Utilizando Real-PCR cuantitativa en tiempo

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

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Biology

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

10.6K vistas.  The Ohio State University. Cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) es una herramienta eficaz para el diagnóstico de los niveles de mRNA en tejidos de insectos y diferentes etapas de desarrollo. En este informe se muestra el uso de QRT-PCR para determinar los niveles de ARNm en diferentes tejidos y estadios de desarrollo larvario de las especies de insectos invasores, el barrenador esmeralda del fresno.

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Gen bacteriano y Análisis de Expresión El uso de microarrays

Investigación

Biología

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Gene mundial y Análisis de Expresión utilizando una plataforma de microarrays de oligonucleótidos de pez cebra

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Cuantitativas PCR en tiempo real utilizando el Thermo Scientific Solaris qPCR ensayo

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Perfiles de Pre-micro ARN y microRNAs utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

La determinación de perfiles genéticos de expresión en C. elegans Utilización de microarrays y PCR en tiempo real

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...