El ARNi se ha convertido en un método eficaz para identificar la función de los genes en los nematodos y se proponen como una nueva forma de controlar eficazmente los nematodos patógenos. El ARNi está empapando nematodos en dsRNA puede ser suficiente para el procedimiento. Para comenzar, recoge los nematodos por el método del embudo de Baermann.
Para esto, coloque un tubo de goma sujetado debajo de un embudo y coloque dos capas de papel de filtro en la boca del embudo. Transfiera los cultivos fúngicos de Botrytis cinerea al embudo y agregue agua para sumergir la estera fúngica. Cuando se recolecten nematodos, agregue 500 microlitros de reactivo de extracción y 100 microlitros de perlas magnéticas a un tubo de centrífuga de dos mililitros.
Aspirar 20 microlitros de los nematodos y moler las muestras a 9, 000 x g durante 30 segundos. Incubar durante cinco minutos y centrifugar a 12, 000 x g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga nuevo.
Añadir 100 microlitros de cloroformo y mezclar invirtiendo el tubo varias veces. Incubar durante tres minutos y luego centrifugar a 12, 000 x g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Nuevamente, transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga nuevo.
Agregue 250 microlitros de alcohol isopropílico y vortex vigorosamente. Centrifugar a 12, 000 x g durante 10 minutos y vórtice. Deseche el sobrenadante y agregue 500 microlitros de etanol al 75% para lavar el ARN.
Vortex la muestra seguida de centrifugación a 12, 000 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Seque al aire el pellet de ARN durante cinco minutos y vuelva a suspenderlo en 30 microlitros de agua libre de RNasa. Calcule la concentración de ARN utilizando esta fórmula y calcule la proporción A260 a A280.
A continuación, use un par de cebadores para amplificar la secuencia de codificación parcial del gen BX ppm-1 del B.xylophilus. Luego clone las secuencias del gen ppm-1 en un vector pGEM-T Easy que contiene el promotor T7. Recuperar el fragmento de gen ppm-1 largo del par de bases 894 utilizando el plásmido clonado como plantilla para pcr.
Luego, use un kit de transcripción in vitro para sintetizar el dsRNA. Analice la calidad del dsRNA utilizando un espectrofotómetro y visualice los productos en un gel de agarosa al 1%. Agregue cuatro microlitros de tampón de remojo 5X y enrase el volumen a 20 microlitros con agua destilada doble para obtener una concentración final de ARN de 0.8 microgramos por mililitro.
Luego coloque los nematodos en el plato durante 30 minutos y espere a que los huevos se adhieran al fondo. Retire con cuidado el agua y los nematodos sin alterar los huevos hasta que solo los huevos permanezcan en el plato. Incubar los huevos recolectados en la oscuridad a 25 grados centígrados durante 24 horas para obtener larvas J2.
Recoja las larvas en un tubo y lávelas tres veces con agua destilada doble. Luego, transfiera las larvas al tubo que contiene la solución de dsRNA. A esto, agregue la solución de resorcinol para obtener una solución al 1%.
Coloque las larvas en una mesa de agitación para asegurar una absorción suficiente de dsRNA en las larvas. Para los controles, remoje la misma cantidad de nematodos en el tampón de remojo sin la sonda dsRNA o con una sonda GFP dsRNA. Realizar una qPCR utilizando los genes actB y tbb-2 como referencias internas para evaluar los cambios en el nivel de expresión génica.
Utilice el método delta delta Ct para estimar el nivel relativo de expresión génica a partir de la curva de disolución y el valor de Ct. Después del ARNi, cultivar las larvas J2 hasta la edad adulta en céspedes de Botrytis cinerea en placas PDA. Recoja a los adultos utilizando el método del embudo de Baermann, como se muestra en la sección uno.
Adquiera imágenes de los nematodos adultos bajo un microscopio y use el software ImageJ para medir la longitud corporal de 50 nematodos machos y 50 hembras. Analice los datos calculando la media y la desviación estándar para cada muestra. Aplicar la prueba t de Student para comparar las medias de las muestras de los diferentes grupos.
El análisis relativo de la expresión génica después del ARNi indicó que el ppm-1 dsRNA puede inhibir eficazmente la expresión del ppm-1 un gen de B.Xylophilus. Mientras que el dsRNA exógeno de GFP no tuvo ningún efecto sobre la expresión de ppm-1. Después del ARNi, el tamaño de los adultos disminuyó notablemente a pesar de alcanzar la madurez sexual, lo que resultó en el fenotipo mutante de tamaño corporal pequeño.
La longitud corporal media de las hembras y machos mutantes fue de 544 y 526 micrómetros en comparación con 971 y 912 micrómetros para el grupo de control. Este método es adecuado para la detección de genes a gran escala y se usa comúnmente en la investigación celular. El estudio de la función génica de B.Xylophilus por este método tiene un valor orientador para el control biológico de B.Xylophilus.
