This work was supported by a grant to MEM from the Dept. of Life Sciences and Systems Biology of the University of Turin, Italy. The authors thank G. Gnavi for technical assistance during some experiments. CTR is funded by the Wellcome Trust and the Royal Society (Grant Number 098436/Z/12/Z).

1. Ajuste del triaxial Bobinas NOTA: La Figura 1 muestra las bobinas triaxiales utilizados para revertir la GMF. <ol><li> Encienda el magnetómetro de tres ejes, cuya sonda se inserta en las bobinas triaxiales. </li><li> Encienda el ordenador e inicie el software magnetómetro que permite que los datos se recogen de magnetómetro de tres ejes. </li><li> Usa los valores de los componentes reportados por el magnetómetro para calcular la magnitud de la GMF. Por ejemplo, con valores magnetómetro: Bx = 6,39 mT, By = 36,08 mT, Bz = 20,40 mT calcular la intensidad de campo de 41.94 mT utilizando la siguiente ecuación: B = B GMF + B adicional, donde B adicional = (Bx 2 + Por 2 + Bz 2) ½ (es decir, el 41,9 mT en el ejemplo.) </li><li> Encienda las tres fuentes de alimentación de corriente continua (doble rango: 0-8V / 5A y 0-20V / 2.5A, 50W), cada uno conectado a tres couples de bobinas de Helmholtz y conectado a un ordenador a través de una conexión GPIB (Figura 1B). </li><li> Set tensiones de las fuentes de alimentación para generar el campo magnético deseado con un vector de campo magnético invertido. Por ejemplo, con B GMF como en el paso 1.3 y con el tamaño de la bobina de la instrumentación se describe aquí, establecer los voltajes a V x = 0,00 V, V y = 30,52 V, V z = 0,00 V con el fin de generar una nueva resultante B = bobinas triaxiales B GMF + B = (6.38, -36.08, 20.39) mT. es decir, un nuevo campo con la misma magnitud que B GMF, pero que apunta a una dirección diferente. </li><li> Verificar el nuevo campo con el software magnetómetro utilizando el procedimiento descrito en 1.3. </li><li> Exponer a las plantas normales y revertido condiciones GMF utilizando placas de Petri como se describe en la sección 2. </li><li> Realizar experimentos de exposición simulada manteniendo la magnitud del campo igual a | B GMF | y mantenimientola componente vertical del campo igual a la de la GMF, pero la alteración de la dirección (es decir, &quot;Norte, Este u Oeste&quot;) de la componente horizontal del campo con corrientes iguales en las bobinas triaxiales en comparación con la condición de inversión de campo. Para ello, mediante la alteración de la tensión de las bobinas como se describe en 1.5. Nota: Esta exposición simulada descarta potencial de calentamiento sutil o efectos vibracionales de cualquiera de las bobinas de ellos mismos o de los componentes electrónicos utilizados para controlar las bobinas. </li><li> Ejecutar experimentos de doble ciego mediante la aplicación de condiciones de campo a partir de los ciegos el personal que realiza el resto de los experimentos y / o interpretar los datos. </li></ol> 2. Preparación de los materiales y condiciones para el crecimiento de la planta de la planta <ol><li> Utilice semillas de Arabidopsis thaliana, ecotipo Columbia 0 (0 Col), a continuación, colocar en un tubo de 1,5 ml y la superficie esterilizar mediante tratamiento con un 5% (w / v) Solución de hipoclorito de calcio y 0,02% (v / v) de Triton X-100% de etanol en 80 (EtOH), 10-12 min a 25-28ºC, con agitación continua. Luego enjuague dos veces con 80% de EtOH, se lava con EtOH al 100% y finalmente enjuagar con agua destilada estéril. </li><li> Preparar 1 l de Murashige y Skoog 22 (MS) modificado mediante la adición: 2.297 g de MS (0,5 x MS basal Sal Mezcla), 10 g de sacarosa, agua desionizada hasta 1 litro, pH 5,8 a 6,0 ajustado con KOH. Añadir 16 g de agar y autoclave durante 20 minutos, 120 ° C. </li><li> Antes de la solidificación, verter 80 ml ​​de medio en cada uno (120 x 120 mm 2) cuadrados placas de Petri. Siembre treinta semillas estériles en la placa, y luego sellar placas con una película de cera. </li><li> Vernalize las placas horizontalmente en la oscuridad a 4 ° C durante 2 días para potenciar y sincronizar la germinación, y luego exponer las placas de Petri ya sea normal o invertido GMF. </li><li> Expose semillas en un entorno de clima controlado a 22 ° C en una posición vertical en experimentos paralelos tanto en el interior de las bobinas triaxiales y fuera de las bobinas triaxialesbajo un horario fotoperíodo de 8 horas oscuridad y 16 horas de luz, con lámparas de vapor de sodio (220 x 10 -6 E m -2 s -1). Utilice una película de gelatina azul para el centro de atención para reducir el componente rojo de las lámparas. </li><li> Exponer las plantas durante 10 días antes de la extracción de ARN tanto normal (control) y la inversión (tratamiento) condiciones GMF. </li><li> Después de la exposición, tomar fotos de placas de Petri. </li><li> Utilice el software ImageJ para calcular áreas de la longitud de la raíz y las hojas. <ol><li> En pocas palabras, medir el lado de la placa de Petri, a continuación, abra la imagen de la placa de Petri y mediante el uso de la opción de línea &quot;recta&quot; para dibujar una línea que cruza exactamente el lado de la placa. </li><li> En el menú de &quot;analizar&quot;, seleccione &quot;escala set&quot; e inserte la distancia real en el cuadro &quot;distancia conocida&quot; (por ejemplo, 120 mm), a continuación, inserte la unidad de longitud (mm); por último, en la opción &quot;global&quot; para realizar los ajustes disponibles para todas las mediciones. </li><li> Para root longitud, siga cuidadosamente la forma de la raíz con la función manos libres. Medir la longitud mediante la opción &quot;medida&quot; en el menú &quot;analizar&quot;. Continuar para medir todas las raíces en la imagen y guardar el archivo para otros análisis estadísticos. </li><li> Para el área foliar, en el menú &quot;imagen&quot; utilice la opción y luego &quot;umbral de color&quot; ajustar. Seleccione la hoja individual y en el menú &quot;analizar&quot;, seleccione &quot;analizar partículas&quot;. Guarde las mediciones individuales para los análisis estadísticos. </li></ol></li></ol> 3. Extracción de ARN total de Arabidopsis, Cuantitativa en Tiempo Real-PCR (qPCR) condiciones de reacción y cebadores para Arabidopsis <ol><li> Recoger por separado 30 brotes y 30 raíces y congelar inmediatamente en nitrógeno líquido. Luego moler en nitrógeno líquido con mortero. </li><li> Aislar ARN total utilizando un kit de purificación y kit de tratamiento RNasa libre de DNasa usando Productoresinstrucciones del er. </li><li> Comprobar la calidad y cantidad de la muestra mediante el uso de un kit de electroforesis de ARN nano y gel capilar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Confirme la cuantificación de RNA por espectrofotometría. </li><li> Utilice 2 g de ARN total y cebadores aleatorios utilizando un kit de transcripción reversa cDNA para obtener primeras cadenas de cDNA de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. </li><li> Realizar todos los experimentos en un tiempo real del sistema utilizando SYBR verde I con ROX como un estándar de carga interna. </li><li> Realizar la reacción con 25 l de mezcla consistente en 12,5 l de 2x SYBR Green qPCR Master Mix, 0,5 l de cDNA y 100 nM primers. Usa los cebadores listados en la Tabla 1. Incluir en los controles controles no-RT (usando ARN total y sin transcripción inversa para supervisar la contaminación de ADN genómico) y controles sin plantilla (agua en lugar de la plantilla). </li><li> Calcular la eficiencia de imprimación para todos los pares de cebadores utilizando el estándarmétodo de la curva 23. </li><li> Utilice las siguientes condiciones de PCR: CRU3, COTP1, RRTF1. 10 min a 95 ° C, 40 ciclos de 15 s a 95 ° C, 30 segundos a 58 ° C y 30 segundos a 72 ° C; UBP6, eEF1Balpha2, ACT1, GAPC2, CAT3, TapX, APX1, RbohD, FeSOD1 10 min a 95 ° C, 40 ciclos de 15 s a 95 ° C, 20 segundos a 57 ° C y 30 segundos a 72 ° C. </li><li> Leer fluorescencia después de cada fase de recocido y la extensión. Para todas las corridas, realizar un análisis de curva de fusión a partir de 55 a 95 ° C mediante la inclusión del segmento de disociación en el perfil térmico. Utilice la pantalla curva de disociación, se accede a través de la pestaña de resultados para ver el perfil de disociación (parcela de la fluorescencia en función de la temperatura). Asegúrese de que se selecciona el conjunto de datos recogidos durante el segmento de la disociación del experimento para el análisis utilizando la pantalla Análisis / Configuración. </li><li> Determinar el linear rango de la concentración de plantilla a valor de ciclo umbral (Ct valor) mediante la realización de una serie de dilución de diez veces (de 1 a 10 3 -fold) usando cDNA a partir de tres extracciones de ARN independientes analizadas en tres repeticiones técnica 24,25. </li><li> Analizar todas las parcelas de amplificación con el Real-Time PCR software del instrumento para obtener los valores de Ct. Calibrar y normalizar los niveles de ARN en relación con el nivel de los mejores genes de limpieza de la siguiente manera: 3.11.1) accede a la pantalla de amplificación parcelas a través de la ficha Resultados, seleccione la rampa o meseta para las que los datos deben ser analizados mediante la pantalla / Configuración de Análisis de Selección, y luego seleccione el DRN (fluorescencia normalizada de referencia corregido) en el menú de la fluorescencia en el panel de comandos. Acceda a la placa de pantalla Valores de ejemplo a través de la pestaña Resultados para mostrar los valores de Ct de los pozos muestreados. </li><li> Utilice cuatro genes de referencia diferentes [por ejemplo, citoplásmica deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato, (GAPC2), specif ubiquitinaic proteasa 6 (UBP6), actina 1 (ACT1) y el factor de elongación 1B subunidad alfa 2 (eEF1Balpha2)] para normalizar los resultados de la PCR en tiempo real. Seleccione el mejor clasificado de genes usando un software de análisis de 26; y utilizar el gen más estable para la normalización. <ol><li> En pocas palabras, organizar los datos de entrada en una hoja Excel con la primera columna que contiene los nombres de genes y primera fila que contienen los nombres de las muestras. A continuación, seleccione el software de análisis de la barra de menú. Utilice el cuadro de diálogo para seleccionar los datos de entrada. </li><li> A continuación, compruebe los campos nombres de ejemplo, los nombres de genes y de salida sencilla solamente. Haga clic en el botón Go para realizar el análisis. Seleccione el gen mejor clasificado (que tiene el valor más pequeño de estabilidad) como gen candidato más establemente expresada. </li></ol></li><li> Datos de trazado, mostrando el cambio de la expresión diferencial de pliegue en ambos brotes y raíces. </li></ol> 4. Análisis estadísticos <ol><li> Expresar los datos como valores medios ± error estándar. Comparación de la control y los grupos de tratamiento mediante la realización de análisis de la varianza (ANOVA) y la prueba de Tukey con Bonferroni y Dunn-Sidak prueba de probabilidad ajustada (0,95% de confianza). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Recientemente hemos demostrado que existe una correlación sorprendente entre las inversiones GMF y el momento en que la desviación de la mayoría de los linajes familiares Angiospermas produjo 2. Sin embargo, a pesar de las hipótesis estimulantes y la gran cantidad de estudios sobre el efecto de variadas intensidades GMF, la suposición de que GMF reversión puede en sí inducir cambios significativos en la expresión de genes de plantas y morfología nunca se ha demostrado. Aquí nos muestran por primera vez, un método que utiliza una bobina de Helmholtz octogonal triaxial para revertir GMF en nuestro laboratorio, y que la inversión del campo magnético ambiental puede causar cambios fenotípicos y la modulación de la expresión génica en las plantas. A fin de obtener GMF reversión (o modificación) en un volumen suficiente para los experimentos de crecimiento de las plantas (2 x 2 x 2 m 3), hemos construido un sistema de bobina de Helmholtz octogonal. Este sistema no está disponible comercialmente (bobinas de Helmholtz están generalmente en forma de anillo y más pequeño)y los costos para la construcción fueron considerables. Es importante destacar que este sistema ofrece la modificación del campo robusta, con el tiempo-estabilidad y homogeneidad excepcional en los campos magnéticos modificados. El sistema está diseñado y construido para reducir el valor de la GMF a una milésima parte de las condiciones normales o revertir cualquiera de las tres dimensiones del campo magnético. Sin embargo, el diseño de las bobinas no permite generar una alta intensidad de campo magnético. Por lo tanto, este instrumento en la forma actual no es adecuado para los experimentos diseñados para evaluar el efecto de la alta intensidad del campo magnético en las plantas u otros organismos. En el laboratorio, la alteración de la GMF similares a los descritos en este método se ha obtenido por diferentes métodos, incluyendo blindaje rodeando la zona experimental por placas metálicas ferromagnéticas con alta permeabilidad magnética, que se desvían los campos magnéticos y se concentran en el seno del propio metal. The ventaja de utilizar bobinas de Helmholtz es que el sistema permite que las plantas sean expuestos a condiciones más naturales (luz, de circulación de aire, etc.), por lo que es ideal no sólo para los estudios in vitro (como con el uso de placas de Petri), sino también en vivo crecimiento de las plantas y los experimentos de desarrollo. Las dimensiones de nuestro sistema de crear un espacio que permita la supresión de hasta &lt;1 / 1.000 de la GMF natural a lo largo de 25 x 25 x 25 cm 3 volumen esférico (ver Figura 1 A), lo que permite acoger varias placas de Petri o algún pequeño ollas para el crecimiento vegetal. El método que aquí se presenta se ha aplicado a estudios de biología vegetal; Sin embargo, el sistema permite una amplia gama de experimentación, incluyendo virología y microbiología, así como los estudios sobre los nematodos (por ejemplo, Caenorhabditis elegans), artrópodos y animales pequeños (incluyendo ratones y ratas). Por lo tanto, las pruebas de la hipótesis de que la inversión de la GMF es capazpara inducir cambios morfológicos y transcripcionales también podrían extenderse a muchos otros sistemas vivos, tal vez en última instancia, incluso a las células humanas. El GMF está en constante cambio y fluctuante. Por lo tanto, en nuestros experimentos Un desafío importante es proporcionar una compensación constante de la GMF el fin de obtener los nuevos valores GMF deseados. Esto sólo se puede lograr mediante un control continuo de valores de los campos magnéticos a través de la lectura de los valores del magnetómetro y compensación de voltaje. Por lo tanto, el sistema puede compensar la parte que varía lentamente de la GMF pero no hace nada por las fluctuaciones de frecuencia más alta. En conclusión, el uso de bobinas triaxiales para invertir el vector GMF fue fundamental para demostrar que esta inversión de la GMF vector es capaz de inducir cambios morfológicos de plantas y la expresión génica diferencial. Los resultados obtenidos con el método presentado proporcionan una evidencia convincente en apoyo de la hipótesis de que la re GMFversales podrían haber sido una de las fuerzas motrices de la evolución de plantas en escalas de tiempo geológicas 2.

El campo magnético de la Tierra (o equivalentemente el campo geomagnético, GMF) es un factor ambiental ineludible para todos los organismos vivos en el planeta, incluyendo las plantas. El GMF siempre ha sido una característica natural de la Tierra, por lo que durante la evolución, todos los organismos vivos experimentado su acción. Un creciente cuerpo de evidencia muestra que el GMF es capaz de influir en muchos procesos biológicos 1. El GMF no es uniforme y hay diferencias locales significativos en su magnitud y dirección en la superficie de la Tierra. El GMF en la superficie de la Tierra muestra una amplia gama de magnitudes, que van desde menos de 30 mT a casi 70 mT. El GMF protege a la Tierra y su biosfera de los efectos letales de viento solar al desviar la mayor parte de sus partículas cargadas a través de la magnetosfera 2. Las plantas responden a los estímulos del medio ambiente; y las respuestas clásicas a factores abióticos como la luz y la gravedad han sido thoroughly descrito mediante la definición de las denominadas respuestas fototrópicos y gravitrópica. Muy poco, o nada, que se conoce sobre los mecanismos de la percepción y las respuestas de las plantas a los campos magnéticos, a pesar de la gran cantidad de trabajos publicados sobre este tema y recientemente revisados ​​1. A diferencia del campo gravitatorio, el GMF cambió consistentemente durante la evolución planta que representa por lo tanto un importante factor estrés abiótico que ha sido considerado recientemente una fuerza impulsora potencial con el tiempo que contribuye a plantar la diversificación y la especiación 2. Reversiones geomagnéticas (o excursiones) son los cambios en la polaridad de la GMF. Durante la historia de vida de la Tierra, las reversiones GMF ocurrieron varias veces. Estos expuestos al planeta a periodos de menor resistencia GMF durante cada transición de polaridad. Algunos autores han planteado la hipótesis de que estas transiciones períodos de baja resistencia GMF podrían haber permitido a las radiaciones ionizantes del viento solar para llegar a la superficie de la Tierra, lo que induce unatensión constante a los organismos vivos, lo que podría haber sido lo suficientemente fuerte como para inducir alteraciones genéticas que finalmente llevan a plantar evolución 2. Un análisis detallado de los experimentos que describen los efectos de los campos magnéticos sobre las plantas muestran un gran número de informes contradictorios, que se caracteriza por la escasez de mecanismos plausibles interacción biofísicos. Muchos experimentos son simplemente poco realista, mientras que otros carecen de una hipótesis comprobable y, en definitiva, no son convincentes 3. En los últimos años, el progreso y el estado de la investigación sobre el efecto de los campos magnéticos en la planta se ha revisado 2,4-11. Recientemente, el efecto del campo magnético de baja y alta se ha discutido a fondo 1, con un enfoque particular en la participación de eventos de reversión GMF en evolución de las plantas 2. Los medios más directos para fundamentar la hipótesis de que las inversiones de GMF afectan evolución de las plantas es sintetizar un GMFreversión en el laboratorio mediante pruebas de la respuesta de las plantas a las condiciones normales de campo magnético y invertidos. Para probar la hipótesis, por lo tanto, construimos una bobina de Helmholtz-pares campo magnético sistema octogonal triaxial compensación (bobinas triaxiales), que es capaz de revertir con precisión las condiciones normales GMF. Se utilizó Arabidopsis thaliana como planta modelo y probamos el efecto de revertido GMF sobre la expresión génica de algunos genes importantes: cruciferina 3 (CRU3), que codifica una proteína de almacenamiento 12S semilla que es tirosina fosforilada y su estado de fosforilación se modula en respuesta a ABA en semillas de Arabidopsis thaliana 12,13; Transporte protein1 de cobre (COTP1), que codifica una proteína de la superfamilia de transporte de metales pesados ​​/ desintoxicación con la función predominante en la adquisición de Cu suelo y el desarrollo del polen 14; y Redox Responsive Transcripción factor1 (RRTF1),que codifica un miembro de la ERF (factor de respuesta de etileno) subfamilia B-3 de la familia del factor de transcripción ERF / AP2 que contiene un dominio AP2 que facilitan la co-activación sinérgica de las vías de la expresión génica y confiere tolerancia cruzada a abiótico y biótico subraya 15. Por otra parte también se analizó cinco genes implicados en las respuestas de estrés oxidativo: Fe superóxido Dismutase1, (FSD1), que codifica una enzima citoplasmática que enzimáticamente y rápidamente convierte el anión superóxido (O 2 -) y agua (H 2 O) a peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) y oxígeno molecular (O2) 16; Catalase3 (CAT3), que codifica y que enzima que cataliza la descomposición de H 2 O 2 en agua y oxígeno 17,18; tilacoidales ascorbato peroxidasa (TapX), que codifica una peroxidasa tilacoide cloroplástica que neutraliza H2O2 19; ascorbato Peroxidase1 (APX1), que codifica una peroxidasa citosólica que neutraliza H 2 O 2 y representa uno de los posibles objetivos de las modificaciones post-traduccionales mediadas por moléculas derivadas-NO 20; y NADPH-oxidasa estallido respiratorio proteína D (RbohD) que codifica una enzima que genera O 2 - y juega un papel fundamental en la regulación del crecimiento, el desarrollo y las respuestas de estrés en Arabidopsis 21. Nuestra metodología de campo-reversión proporciona la primera evidencia de que GMF reversión puede inducir un cambio significativo en la morfología y la expresión génica de A. raíces y brotes thaliana. Este protocolo proporciona una forma innovadora de evaluar el efecto de reversión en GMF morfología de la planta y la expresión génica y se puede utilizar para evaluar el efecto potencial de GMF reversión en otros aspectos del comportamiento de la planta, y de este modo guiar la discusión de la role de GMF reversión en la evolución de las plantas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>three-axis magnetometer</td>
			<td>Bartington&#160;</td>
			<td>Mag-03MC</td>
			<td>triaxial fluxgate magnetometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetometer power supply</td>
			<td>Bartington&#160;</td>
			<td>Mag-03PSU</td>
			<td>triaxial fluxgate magnetometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetometer software</td>
			<td>Bartington&#160;</td>
			<td>Mag03DAM</td>
			<td>triaxial fluxgate magnetometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power supply&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>E3642A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hypochlorite&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>211389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GroLux Sodium vapor lamps&#160;</td>
			<td>OSRAM Sylvania</td>
			<td>600W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plant RNA kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2938B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mx3000P</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Fermentas International, Inc</td>
			<td>K0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog Basal Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5519&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish square (120x120)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z692344&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

geomagnetic field (gmf) and plant evolution: investigating the effects of gmf reversal on arabidopsis thaliana development and gene expression

Una de las observaciones más estimulantes en evolución de las plantas es una correlación entre la ocurrencia del campo geomagnético (GMF) reversiones (o excursiones) y el momento de la radiación de las angiospermas. Esto condujo a la hipótesis de que las alteraciones en GMF polaridad pueden desempeñar un papel en la evolución de las plantas. Aquí se describe un método para poner a prueba esta hipótesis mediante la exposición de Arabidopsis thaliana que invierte artificialmente condiciones GMF. Se utilizó un magnetómetro de tres ejes y los datos obtenidos se utilizaron para calcular la magnitud del GMF. Tres fuentes de alimentación de CC se conectan a tres pares de bobinas de Helmholtz y eran controlados por una computadora para alterar las condiciones GMF. Las plantas cultivadas en placas de Petri fueron expuestos a tanto normales como invierten condiciones GMF. También se realizaron experimentos de exposición simulada. Plantas expuestas fueron fotografiados durante el experimento y las imágenes fueron analizadas para calcular la longitud de la raíz y las áreas de las hojas. ARN total fue extraído de Arabidopsis y cuantitativaTime-PCR real (qPCR) se realizaron análisis de la expresión génica de cruciferina 3 (CRU3), protein1 transporte de cobre (COTP1), Redox Responsive Transcripción factor1 (RRTF1), Fe superóxido dismutasa 1, (FSD1), Catalase3 (CAT3), tilacoidales ascorbato peroxidasa (TapX), un ascorbato citosólica Peroxidase1 (APX1), y NADPH / respiratoria proteína estallido oxidasa D (RbohD). Se analizaron cuatro genes de referencia diferentes para normalizar los resultados de la qPCR. El mejor de los cuatro genes fue seleccionado y se utilizó el gen más estable para la normalización. Nuestros datos muestran por primera vez que invirtiendo la polaridad GMF utilizando bobinas triaxiales tiene efectos significativos en el crecimiento de plantas y la expresión génica. Esto apoya la hipótesis de que GMF reversión contribuye a inducir cambios en el desarrollo de plantas que podrían justificar una mayor presión selectiva, llevando eventualmente a pevolución lant.

El objetivo de este protocolo es proporcionar un método para evaluar si la inversión del campo geomagnético (GMF) puede afectar el desarrollo de la planta y la expresión de genes de Arabidopsis thaliana ecotipo Col 0. bobinas triaxiales como se muestra en la Figura 1A se utilizan para revertir la GMF en conjunto con las tensiones de accionamiento adecuados (Figura 1B), obtenida como se describe en el paso 1.5 en el protocolo. Las dimensiones de las bobinas triaxiales son ~ 2 x 2 x 2 m 3, lo que permitió un espacio suficiente con condiciones GMF invertidas para acoger varias placas de Petri. Los controles se cultivaron en las mismas condiciones ambientales y a valores normales GMF. Después de 10 días de exposición a la normalidad y revertido condiciones GMF, el fenotipo de las plantas mostraron alteraciones morfológicas evidentes. Como se muestra en la Figura 2, las plantas de control (es decir, cultivadas en condiciones normales GMF) mostraron longitudes de raíz con Prob significativamente (Dunn-Sidak y Bonferroni Ajustado &lt;0,001;T de Student = 10,68, df = 31) valores más altos (29,41 mm; SEM = 1,04; N = 32) con respecto a las plantas expuestas a invertido GMF (17,53 mm; SEM = 0,58; N = 36). En las plantas invertidas-GMF, la morfología de los brotes también fue alterada por mostrando una reducción del desarrollo de la expansión del prospecto. Las plantas expuestas a condiciones normales mostraron una superficie media de la hoja de 4,95 mm 2 (SEM 0.025, N = 54), mientras que las plantas expuestas a condiciones GMF invertidos mostraron significativamente (Dunn-Sidak y Bonferroni ajustado prob = &lt;0,001; t de Student = 31,32, df = 53) los valores más bajos de la hoja de área (3,71 mm 2; SEM = 0,032, n = 54). Por lo tanto, la exposición de Arabidopsis a condiciones GMF invertidos indujo una reducción en longitud de la raíz y el área foliar. Expansión de las hojas y el crecimiento de la raíz son depende tanto de la división y el alargamiento de las células 27. Por lo tanto, el desarrollo de la planta, la productividad y el estado físico general dependen de un DISPARO y sistema radicular arquitectura óptima &lt;sup&gt; 28. La longitud de la raíz y la hoja de tamaño reducido de las plantas expuestas a condiciones GMF invertidos indican la presencia de un sistema de detección capaz no sólo de percibir las variaciones en la intensidad del campo magnético, sino también para responder a los cambios en el campo &quot;dirección&quot; magnética en comparación con la gravedad. La hipótesis de que GMF reversión puede afectar el crecimiento de plantas encuentra evidencia convincente en nuestros experimentos, que demuestran que las condiciones de reversión GMF pueden afectar de manera significativa el desarrollo de la planta. Los cambios morfológicos también fueron acompañados por cambios en la expresión génica. Entre los genes de limpieza, el gen más estable fue el factor de elongación 1B subunidad alfa 2. El primer grupo de genes (CRU3, COTP1, RRTF1) mostró una alteración drástica en la expresión de genes (Figura 3). Shoot expresión de los tres genes se incrementó significativamente (P &lt;0.05) en aproximadamente 2,5 veces mayor en las plantas expuestas a la reservad condiciones GMF. Expresión Raíz de CRU3 se upregulated en las raíces de las plantas expuestas a condiciones normales GMF, pero fue significativamente (P &lt;0,05) downregulated en condiciones GMF invertidos. Lo opuesto se encontró para COTP1 y RRTF1, que fueron downregulated en condiciones normales y upregulated en la presencia de GMF reversión (Figura 3). Cruciferina (una globulina 12 S) es la proteína más abundante de almacenamiento en las semillas de A. thaliana y otras crucíferas y se sintetiza como un precursor en el retículo endoplásmico rugoso. A continuación, se transporta a las vacuolas de almacenamiento de proteínas 13. Planta de semillero de germinación requiere la ruptura de cruciferina, que se utiliza como fuente inicial de nitrógeno. Down-regulación de cruciferina degradación reduce el desarrollo de los embriones al dañar las estructuras celulares o componentes celulares de desarrollo 29,30. Nuestros resultados muestran que la regulación positiva de CRU3 se correlaciona conuna expansión inferior de las hojas y una longitud reducida de la raíz, lo que indica que este gen en sensibles a GMF reversión y que su sobreexpresión puede contribuir a la reducción del desarrollo de la planta. Por otra parte, GMF reversión induce una regulación a la baja significativa de CRU3 en las raíces, que se correlaciona con una longitud de la raíz reducida. El cobre es un cofactor esencial para procesos clave en las plantas, pero que ejerce efectos dañinos cuando están en exceso; por lo tanto, que sobreexpresa el transporte de cobre compromete el crecimiento vegetal. El efecto de GMF reversión fue una sobreexpresión significativa de COTP1 en ambos brotes y raíces, lo que explica el crecimiento vegetal reducida. Ion estrés afecta el metabolismo del cloroplasto, que está estrechamente vinculada con el estado redox de la célula. En Arabidopsis el factor de transcripción RRTF1 es importante para la expresión de genes asociados a la capacidad de adaptarse a los cambios redox 31. Por lo tanto, cuando las plantas están expuestas a los estímulos externos capaz de alterar su desarrollo fisiológico yprogramas de AL se espera que una sobreexpresión de este factor de transcripción importante. La inversión de la GMF indujo una sobreexpresión significativa de RRTF1 en ambos brotes y raíces, lo que indica las respuestas al estrés oxidativo más altos de las plantas a condiciones GMF invertidos. Interés resultados se obtienen mediante el análisis de los cinco genes implicados en el estrés oxidativo. En general, todos los genes extraídos y analizados en los brotes no mostraron diferencias significativas (P&gt; 0,05) cuando las plantas se cultivan en condiciones normales o invertidas GMF (Figura 4 y Figura 5). Sin embargo, una baja regulación significativa siempre se observó en las raíces de las plantas expuestas a condiciones GMF invertidos. En particular, CAT3 mostró la mayor regulación a la baja (Figura 5), seguido en orden de regulación a la baja por APX1, FSD1, RBOHD y TapX (Figura 4). La tolerancia cruzada a unestrés biótico y biótico es proporcionada por la activación de diferentes genes implicados en varias vías bioquímicas. factor de transcripción RRTF1 facilita la co-activación sinérgica de la expresión génica de estas vías 15,31, y puede ser potencialmente implicados en el estrés oxidativo 32. Por lo tanto, se espera que cuando se reduce la eliminación de oxígeno regulación al alza de RRTF1. Regulación a la baja de las enzimas de barrido de la raíz se correlaciona con la regulación al alza de RRTF1, que actúa en respuesta a un aumento del estrés oxidativo. La regulación a la baja de la raíz dramática de CAT3, APX1 y TapX indica la disminución de la capacidad de células de la raíz para secuestrar H 2 O 2, que se acompaña por la reducida capacidad de dismutan el anión superóxido por regulación a la baja de FSD1. Las respuestas al estrés oxidativo es mayor en las raíces, que parecen ser el sitio principal de la percepción GMF invertido. Figura 1. Sistema de Compensación campo geomagnético. (A) bobinas triaxial (que comprenden un par de bobinas octogonales para cada uno de tres ejes perpendiculares) utilizados para invertir el vector del campo geomagnético. (B) Una fuente de alimentación controlado por ordenador se conecta a cada par de bobinas de Helmholtz. (Tensiones en estas cifras son arbitrarias) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig2.jpg" /> Figura 2. Efectos de la inversión del campo geomagnético en Arabidopsis morfología. Después de diez días de exposición, las plantas de control (es decir, las personas expuestas a condiciones normales GMF) muestran una significativamente mayor longitud de la raíz y más expanfolletos ded en comparación con las plantas que fueron expuestos a condiciones GMF invertidos. Bar Métricas = 18 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig3.jpg" /> Figura 3. Efectos de la inversión del campo geomagnético en la expresión de genes de Arabidopsis. Después de diez días de la exposición, el ARN total de control y las plantas tratadas se extrajo y se analizó por PCR en tiempo real para el análisis de la expresión. El efecto de la inversión de la GMF era para inducir un cambio drástico en la expresión del gen de todos los genes que se probaron CRU3, Cruciferina 3;. COTP1, Copper Transporte protein1; RRTF1, Redox Responsive Transcripción factor1. Las barras indican el error estándar; asteriscos indica significativas (P &lt;0,05) entre plhormigas expuestas a condiciones GMF invierte y normales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig4.jpg" /> Figura 4. Efectos de la inversión del campo geomagnético en Arabidopsis la expresión de genes relacionados con antioxidantes. Después de diez días de la exposición, el ARN total de control y las plantas tratadas se aísla y se empleó para el análisis de la expresión génica mediante PCR en tiempo real. El efecto de la inversión de la GMF era para inducir cambios significativos en la expresión génica rodaje; sin embargo, una regulación a la baja drástica se observó en la raíz de la expresión génica de las plantas cultivadas bajo condiciones GMF invertidos TapX, tilacoidales ascorbato peroxidasa;. APX1, ascorbato Peroxidase1; FSD1, Fe superóxido Dismutase1; RbohD, NA. DPH / respiratoria ráfaga oxidasa proteína D Las barras indican el error estándar; asteriscos indica significativas (P &lt;0,05) las diferencias entre las plantas expuestas a condiciones GMF invertidas y normales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig4large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig5.jpg" /> Figura 5. Efectos de la inversión del campo geomagnético en Arabidopsis catalasa 3 (CAT3) la expresión génica. Después de diez días de la exposición, el ARN total de control y las plantas tratadas se aísla y se empleó para el análisis de la expresión génica mediante PCR en tiempo real. El efecto de la inversión de la GMF era para inducir cambios significativos en la expresión génica rodaje; sin embargo, una regulación a la baja drástica se observó en la raíz de la expresión de genes de plantas que crecen bajo condiciones GMF invertidos. Las barras indican erro estándarr; asteriscos indica significativas (P &lt;0,05) las diferencias entre las plantas expuestas a condiciones GMF invertidas y normales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig5large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.

Campo geomagnético (Gmf) y evolución de las plantas: La investigación de los efectos de Gmf Reversión en<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Desarrollo y Expresión Génica

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

geomagnetic-field-gmf-plant-evolution-investigating-effects-gmf

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

13.0K vistas.  University of Turin. This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.

Video: Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Cultura de embriones de ratón explantes cocleares y Gene Transfer por electroporación

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

Terapia génica adenoviral para Diabetic Queratopatía: Efectos en la curación de heridas y Stem Cell expresión del marcador en córneas de órganos cultivados humanos y células epiteliales Limbal

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

La microinyección de embriones y la electroporación en el Chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

Una cámara simple para la formación de imágenes confocales a largo plazo del desarrollo de raíces y hipocótilo

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

Un método para la caracterización de embriogénesis en Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Cultivo de óvulos para la proyección de imagen de cigoto polarización de Live-celular y patrones del embrión en Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday products. They are classified as endocrine disrupting compounds (EDC) with estradiol-like properties. Long-term exposure to EDCs, even at low doses, has been linked with various health defects including cancer, behavioral disorders, and infertility, with greater vulnerability during early developmental periods. To study the effects of BPA on the development of neuronal function, we used an in vitro neuronal network derived from the early chick embryonic brain as a model. We found that exposure to BPA affected the development of network activity, specifically spiking activity and synchronization. A change in network activity is the crucial link between the molecular target of a drug or compound and its effect on behavioral outcome. Multi-electrode arrays are increasingly becoming useful tools to study the effects of drugs on network activity in vitro. There are several systems available in the market and, although there are variations in the number of electrodes, the type and quality of the electrode array and the analysis software, the basic underlying principles, and the data obtained is the same across the different systems. Although currently limited to analysis of two-dimensional in vitro cultures, these MEA systems are being improved to enable in vivo network activity in brain slices. Here, we provide a detailed protocol for embryonic exposure and recording neuronal network activity and synchrony, along with representative results.

Exposure to environmental toxins can acutely impact developing embryos. Endocrine disrupting chemicals such as bisphenols are known to adversely affect the nervous system. Here we describe a protocol using an in vitro vertebrate (chick embryo) neuronal network model to study the functional impact of toxin exposure on early embryos.

Evaluación de los efectos del sistema endocrino interrumpir compuestos en el desarrollo de la función de red neuronal vertebrados utilizando electrodos múltiples

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, especially, in plant reproductive biology. However, plant morphological, anatomical, and ultrastructural analyses traditionally involve time-consuming embedding and sectioning procedures for bright field, scanning, and electron microscopy. Recent progress in confocal fluorescence microscopy, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopic analyses, and the continuous refinement of molecular techniques to be used on minimally processed whole-mount specimens, has led to an increased demand for developing efficient and minimal sample processing techniques. In this protocol, we describe techniques for properly dissecting Arabidopsis flowers and siliques, basic clearing techniques, and some staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

In this protocol, we describe techniques for the proper dissection of Arabidopsis flowers and siliques, some basic clearing techniques, and selected staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount y coloración de silicuas y órganos flor de Arabidopsis

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

Microdisección de captura láser de cartílago embrionario de ratón y hueso para análisis de expresión génica

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

Traducción de la purificación de afinidad de ribosoma (TRAP) para investigar el desarrollo de la raíz de Arabidopsis thaliana a una escala específica de tipo de célula

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...