Para comenzar, lave las iPSC cultivadas con PBS o DPBS de Dulbecco. Y añadir un mililitro de mezcla proteolítica y colagenolítica. Incubar el plato a 37 grados centígrados durante dos minutos para separar las células.
A continuación, agregue 1,5 mililitros de medio de cultivo iPSC precalentado para detener la reacción. Disocie las células de la placa de cultivo celular pipeteando hacia arriba y hacia abajo de siete a 10 veces para obtener una suspensión de una sola célula. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga cónica de 15 mililitros.
Peletizar las células a 200xg durante cinco minutos a temperatura ambiente. Y aspirar el sobrenadante. Resuspender el pellet en dos mililitros de medio de cultivo iPSC suplementado con 50 micromolares Y27632.
Ahora, use 10 microlitros de la suspensión celular para contar las células usando una cámara Neubauer. Ajustar la concentración de la suspensión celular a 9, 000 células por 150 microlitros utilizando medio de cultivo iPSC suplementado con 50 micromolares Y27632. Para generar cuerpos embrioides o EB, agite el tubo de suspensión celular para evitar la sedimentación celular antes de sembrar 150 microlitros de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fijación ultrabaja.
Cultive los EB en un ambiente humificado durante 48 horas. Al final de la incubación, retire 100 microlitros de medio por pozo. Y agregue 150 microlitros de medio fresco precalentado sin Y27632.
Cree una rejilla de hoyuelos de cuatro por cuatro en el parafilm colocando la rejilla de parafilm en el estante de tubos de 0,2 mililitros con el lado envuelto en papel hacia arriba. Y presione suavemente un dedo enguantado contra cada orificio del bastidor para incrustar los EB en la matriz de la membrana basal. Luego retire el papel y corte la rejilla de hoyuelos del cuadrado de parafilm con tijeras para ajustar su tamaño para que quepa en un plato de cultivo celular de 60 mililitros.
Coloque el parafilm con hoyuelos de nuevo en el estante de tubos de 0,2 mililitros para proporcionar una base para la generación de gotitas de la matriz de la membrana basal. Transfiera cuidadosamente los EB uno tras otro desde el pozo de la placa de cultivo a los hoyuelos de parapelícula usando una pipeta con una punta de pipeta cortada de 200 microlitros. Después de mover 16 EB a la red, tome una nueva punta de pipeta de 200 microlitros y retire el medio restante de los hoyuelos.
Ahora, pipetea una gota de matriz de membrana basal sobre cada hoyuelo que contenga un EB. Tome una punta de pipeta de 10 microlitros y mueva rápidamente los EB al centro de cada gota sin alterar los bordes de la gota. Coloque la parapelícula con hoyuelos con las gotas de la matriz de la membrana basal en una placa de cultivo celular de 60 milímetros. E incubar durante 15 a 30 minutos a 37 grados centígrados para permitir que la matriz polimerice.
Además, para separar los EB incrustados en la matriz del parafilm, agregue cinco mililitros de medio de diferenciación sin vitamina A al plato. Y voltee el cuadrado de parafilm boca abajo usando pinzas para que el lado con los EB esté orientado hacia el fondo del plato. Agite cuidadosamente el plato para separar las gotas de la matriz de la membrana basal que contienen los EB del parafilm.
Si algunos de ellos todavía están unidos, tome un borde del cuadrado de parafilm con pinzas y enróllelo rápidamente hacia el centro del plato varias veces. Luego cultive los organoides cerebrales en un agitador orbital a 55 rpm en una atmósfera humidificada con 5% de dióxido de carbono y 95% de aire a 37 grados centígrados. Mantenga los organoides en DM sin vitamina A con cambios medios cada dos días.
Se muestra una imagen de campo brillante de un organoide cerebral humano post-siembra de 32 días con estructuras similares a ventrículos en la periferia y una morfología compacta y saludable.
