El método presentado en este artículo surgió de un trabajo financiado por el BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) y una beca de doctorado MRC (MH).

Nota: Todos los experimentos se realizaron con arreglo a la del Kings College de Londres, Reino Unido y las pautas de cuidado de animales Reino Unido Home Office. 1. Disección de e14 Cerebelo <ol><li> Incubar huevos marrones gallina embrionados a 38 ° C para el día embrionario 14. </li><li> Con una tijera de huevo decapitan embrión de pollo in ovo y quitar la cabeza a una placa de Petri que contiene el hielo frío PBS (Figura 1). </li><li> Con unas pinzas estándar, hacer incisiones detrás de cada ojo todo el camino a través del tejido, la eliminación de los ojos y la mandíbula superior. Hacer una segunda incisión todo el camino a través de la faringe retirar la mandíbula inferior (Figura 1B). </li><li> Con unas pinzas estándar, quitar toda la piel de la superficie del cráneo pelando lejos (Figura 1C) y retirar los huesos frontal y parietal, revelando cerebro. </li><li> Desde un aspecto ventral, eliminar el cartílago de la faringe y el mesénquima auxiliar. </li><li> Desde una cara dorsal, cuidadoly eliminar dorsal mesénquima al cerebro posterior teniendo cuidado de no dañar pia, y el cerebro entero separado (Figura 1D). </li><li> Hacer incisión todo el camino a través del tejido entre el cerebro medio y cerebro posterior y el cerebro posterior separada incluyendo cerebelo (Figura 1E). </li><li> Al hacer incisiones todo el camino a través del tejido en ambos cruces laterales del cerebelo y la placa alar del cerebro posterior, retire toda cerebelo, teniendo cuidado de mantener la integridad de la pia en toda la disección (Figura 1F). Retire la formación de plexo coroideo (Figura 1G). </li><li> Mueva el cerebelo diseccionado en hielo frío HBSS. </li></ol> 2. Cortar Cultura de e14 Cerebelo <ol><li> Transferir todo el cerebelo a la plataforma estéril de un tejido Chopper usando una espátula o una pipeta Pasteur 3 ml con la punta cortada para ensanchar la abertura. Retire el exceso de líquido con una pipeta. </li><li> Cortar toda cerebelo todo en tque requiere orientación a 300 micras de espesor usando el cortador de tejidos ajuste a una velocidad de corte a 50% del máximo. La integridad del tejido es más fácil de conserva en corte sagital; Sin embargo, la orientación es también una consideración importante para el análisis de células (células de Purkinje dendritas se sagitalmente alineados, mientras que los axones de células granulares corren transversalmente, perpendicular al plano de las dendritas células de Purkinje). </li><li> Utilizando una pipeta Pasteur de 3 ml, cubra el cerebelo en rodajas en el hielo frío HBSS. </li><li> Transfiera las rebanadas en HBSS a una placa de Petri de 60 mm que contiene hielo frío fresco HBSS usando una pipeta Pasteur 3 ml con punta de corte. </li><li> Bajo un microscopio de disección iluminado con una fuente de luz de fibra óptica, que exista una separación de las rebanadas individuales utilizando fórceps relojero. Identificar las rebanadas que se electroporación, basada en su integridad del tejido y la posición medio-lateral. Nota: Cada disección del embrión a través de cortar la incubación en medio de cultivo tarda alrededor de 10 a 20 minutos dependiendo upoexperiencia n. Realizar disecciones uno a la vez para asegurar que cerebella pasar cantidad mínima de tiempo entre decapitación y cultivo ex vivo. </li></ol> 3. La electroporación de Slices <ol><li> Construir una cámara de electroporación mediante la fijación del ánodo de un electroporador a la base de un 60 mm placa de Petri con cinta aislante. Añadir aproximadamente 1 ml de HBSS para cubrir el electrodo. </li><li> Coloque un inserto de 0,4 micras cultura en la parte superior del electrodo cubierto en HBSS. Deje que el inserto de la cultura para descansar en el electrodo asegurándose de que no siempre es el contacto entre el inserto y el electrodo. Nota: En esta configuración, el inserto de cultivo con las rodajas descansará sobre la superficie de la solución, manteniendo el circuito pero permitiendo la orientación espacial del cátodo. </li><li> Rebanadas identificados transferencia (hasta cinco por la cultura de inserción) sobre inserto de cultivo utilizando 3 ml pipeta Pasteur con la punta de corte. Separar y dejar reposar en inserto de cultivo en un sagittorientación al. </li><li> Con una pipeta, eliminar el exceso de HBSS para que las rebanadas ya no son bañados en solución. </li><li> Utilizando una punta de pipeta P10, el ADN de la pipeta (a una concentración de 1 g / l) diluido con 20% verde rápido sobre la superficie de la región de orientación de una rebanada. 20% verde rápido asegura solución de ADN viscoso y evita prohibitivamente amplia dispersión de ADN. Añadir aproximadamente 5 ADN l / solución verde rápido para cada sector (Figura 2B). </li><li> Coloque el cátodo sobre tejido objetivo deseado y electroporar con 3 x 10 V, 10 pulsos mseg de duración. Evitar el contacto directo del cátodo con el tejido. En lugar de ello, se aprovechan de la tensión superficial del líquido para mantener la conductancia (colocar el cátodo tan cerca del tejido como sea posible sin tocar realmente el tejido). </li><li> Repita la entrega de ADN y la electroporación a múltiples regiones de EGL en cada rebanada cerebelosa individuo si lo deseas. </li><li> Al término de la electroporación, inse cultura transferenciart a 30 mm placa de Petri. </li><li> Para cada cultivo, añadir 1 ml de medio de cultivo precalentado (medio basal de Eagle, 0,5% (w / v) D - (+) - glucosa, 1% de suplemento de B27, 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina) por debajo de la inserción de cultivo de tal manera que el inserto de cultivo está en contacto con el medio, pero rodajas no se bañan en ella. </li><li> Incubar los cultivos a 37 ° C / 6% de CO 2 durante un máximo de 3 días. Reemplace todo el medio de cultivo cada 24 hr con medio precalentado fresco. </li><li> A raíz de la cultura, fijar las rebanadas en la cultura inserta durante 1 hora en paraformaldehído al 4% (o O / N a 4 ° C) en un nuevo plato de 30 mm sin medios de cultivo. </li></ol> 4. Obtención de imágenes de cerebelosos Rebanadas <ol><li> Después de la fijación, lavar rebanadas 3 veces durante 5 min en PBS. </li><li> El uso de una hoja de afeitar, diseccionar cada rebanada cerebelosa electroporación y culta de la inserción del cultivo cortando alrededor de la porción y la eliminación de la división y la región de inserción que se adhiere a. HacerNo intente extraer la rebanada de la superficie de inserción del cultivo. </li><li> Mount rodajas de aproximadamente 1 ml de medio de montaje que contiene DAPI (si se desea) bajo un cubreobjetos con cuidado de no introducir burbujas, y la imagen mediante escaneo láser microscopía confocal. Nota: los parámetros de imagen se pueden variar de acuerdo con las construcciones de electroporación, y a discreción del usuario individual. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

El protocolo informó aquí describe un método para la disección, la electroporación y cultivo de rebanadas de embrionario Día 14 cerebelo del polluelo. Este protocolo permite la focalización de electroporación para pequeñas regiones focales de la EGL, incluyendo aislados focalización de los lóbulos del cerebelo individuales. Permite el análisis genético y de imagen en alta resolución y conveniencia, ya un bajo costo en comparación con las técnicas establecidas en roedores 43-47. Este análisis ...

El cerebelo se encuentra en el extremo anterior de la parte posterior del cerebro y es responsable de la integración de procesamiento sensorial y motora en el cerebro madura, así como la regulación de los procesos cognitivos superiores 1. En los mamíferos y las aves, posee una morfología elaborado y está fuertemente foliada, un producto de la extensa amplificación de tránsito de progenitores durante el desarrollo que produce más de la mitad de las neuronas en el cerebro adulto. El cerebelo ha sido objeto de estudio para los neurobiólogos durante siglos y en la era molecular asimismo ha recibido mucha atención. Esto se refiere no sólo a su biología inherentemente interesante, pero también al hecho de que está fuertemente implicado en la enfermedad humana, incluyendo trastornos genéticos del desarrollo tales como trastornos del espectro autista 2 y lo más prominente que el cáncer cerebelosa, meduloblastoma 3, que es el cerebro pediátrica más frecuente tumor. Es importante destacar que es un excelente sistema modelo dentro which para estudiar la asignación de destino y la neurogénesis durante el desarrollo cerebral 4. En los últimos años, también se ha establecido como un sistema modelo para el estudio comparativo del desarrollo del cerebro, debido a la gran diversidad de formas de cerebelo visto a través de la filogenia de los vertebrados 10.5. El cerebelo se desarrolla desde el medio dorsal de rhombomere 1 en el cerebro posterior 11 y su desarrollo se compone de dos poblaciones progenitoras primarias, el labio rómbico y la zona ventricular. El labio rómbico se extiende alrededor de la región dorsal del neuroepitelio del cerebro posterior en la frontera con la placa de techo. Es el lugar de nacimiento de las neuronas excitadoras glutamatérgicas del cerebelo 12.14. La zona ventricular da lugar a las neuronas del cerebelo GABAérgicas inhibitorias, lo más prominente las neuronas de Purkinje grandes 14,15. Más adelante en el desarrollo (desde aproximadamente el día embrionario 13,5 en el ratón; e6 en chick 16), Progen glutamatérgicaITORS migran tangencialmente desde el labio rómbico y formar una capa pial de progenitores: una zona progenitor secundaria llamada la capa de gránulos externa (EGL). Es esta capa que sufre la extensa amplificación de tránsito que lleva a la gran cantidad de neuronas granulares se encuentran en el cerebro maduro. Proliferación en el EGL larga se ha relacionado con la localización sub-pial que resulta de la migración tangencial desde el labio rómbico 17, con el interruptor de salida del ciclo celular y la diferenciación neuronal de células progenitoras que se asocia con su salida de la capa de EGL exterior hacia el centro EGL 18. La migración tangencial extensivo de células granulares post-mitótico en el eje medial-lateral se produce en el medio y EGL interior 19, antes de la migración radial definitiva en la capa de gránulos interior de la corteza cerebelosa maduro. La migración de células del labio rómbico sobre la superficie cerebelosa es dependiente de la señalización de CXCL12 de la pia 20-22 de </sup&gt; Y células granulares expresan el receptor CXCR4 CXCL12. Su migración tangencial es, pues, que recuerda a la de la migración tangencial neocortical poblaciones interneuronas inhibitorias 23-25. Curiosamente, los estudios de microscopía electrónica 17 han sugerido que las células EGL con una morfología proliferativa mantienen contacto pial, que une el comportamiento celular con capacidad proliferativa en una forma que recuerda de los progenitores basales de la corteza de mamíferos 26. Esto se refleja en la estratificación antes mencionado de la EGL en tres subcapas que se definen por ambientes extracelulares distintos y donde los precursores de los gránulos tienen distinta expresión génica signaturas 18. Proliferación de los progenitores en el oEGL se produce con una distribución normal de tamaños de clones de tal manera que cuando los progenitores son individualmente marcadas genéticamente al final del desarrollo embrionario en el ratón, dan lugar a un promedio de 250-500 g mediana de postmitoticneuronas ranule 27,28. Proliferación depende de la señalización de SHH mitogénica de las neuronas de Purkinje subyacente 29-32. La capacidad de responder a SHH ha demostrado ser totalmente dependiente de la expresión autónoma de células del factor de transcripción Atoh1, tanto in vitro como in vivo 33 34,35. Del mismo modo, salida del ciclo celular y la diferenciación se ha demostrado que dependen de la expresión del factor de transcripción aguas abajo NeuroD1 36, que es probable que un represor directa de Atoh1 37. A pesar de este progreso, y un considerable avance en el desciframiento de la base biológica de células de salida del ciclo celular 38 a 42, el mecanismo molecular fundamental (s) que subyacen a la decisión de salir del ciclo celular y la transición de un progenitor a una neurona diferenciación y la la migración tangencial postmitotic asociada en el EGL interior, así como el interruptor de tardea la migración radial, siendo incompleta entendido. Esto es en gran medida debido a la intratabilidad experimental de la EGL: se está desarrollando tarde, y difícil de dirigir genéticamente ya que muchas de las mismas moléculas neurogénicos también son cruciales antes en la vida de los precursores de gránulos en el labio rómbico. Para superar este problema, numerosos autores han desarrollado in vivo y ex vivo electroporación como un método para dirigir el cerebelo postnatal en roedores 43-48. Aquí, pioneros en el uso de la electroporación ex vivo en chick para estudiar la EGL, que representa considerables ventajas en términos de coste y conveniencia. Nuestro método de electroporación y cultivo ex vivo rebanada de tejido cerebeloso chica utiliza el tejido diseccionado a partir del día embrionario 14 pollitos en el pico de la proliferación de EGL. Este método permite la orientación genética de la EGL independientemente del labio rómbico y será el escenario para la disección genética de la transición del gránuloprogenitoras de neuronas gránulo postmitotic en el cerebelo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Mickle Laboratory Engineering Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Cut at 300&#956;m for best results.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basal Medium Eagle (Gibco)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4&#956;m culture insert</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSS20 Ovodyne electroporator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Intracel</td>
			<td style="width:119px;">01-916-02</td>
			<td>Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors

La capa externa del gránulo cerebelosa (EGL) es el sitio de la amplificación de tránsito más grande en el cerebro en desarrollo, y un excelente modelo para el estudio de la proliferación y diferenciación neuronal. Además, las modificaciones evolutivas de su capacidad proliferativa han sido responsables de la dramática expansión del tamaño del cerebelo en los amniotas, por lo que el cerebelo un excelente modelo para estudios de evo-devo del cerebro de los vertebrados. Las células que constituyen el EGL, progenitores granulares del cerebelo, también representan una célula importante de origen para el meduloblastoma, el tumor neuronal pediátrica más frecuente. Después de la amplificación de tránsito, los precursores de gránulos migran radialmente en la capa granular interna del cerebelo donde representan la mayor población neuronal en el cerebro mamífero maduro. En polluelo, el pico de la proliferación EGL se produce hacia el final de la segunda semana de gestación. Con el fin de apuntar a la modificación genética a esta capa enel pico de la proliferación, hemos desarrollado un método para la manipulación genética a través ex vivo electroporación de rebanadas cerebelo de embriones Día 14 embriones de pollo. Este método recapitula varios aspectos importantes de desarrollo in vivo de las neuronas gránulo y será útil en la generación de un conocimiento profundo de la proliferación de células granulares del cerebelo y la diferenciación, y por lo tanto del desarrollo del cerebelo, la evolución y la enfermedad.

En esta sección se ilustra ejemplos de los resultados que se pueden obtener mediante electroporación y la cultura del cerebelo rebanada de embriones Día 14 pollitos. La disección del cerebelo se ilustra en la Figura 1 y la cámara de electroporación establecido se muestra en la Figura 2. Se demuestra que es posible para electroporar y con éxito rebanadas cerebelares de cultivo, que retienen su estructura y morfolog...

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Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

La capa externa del gránulo del cerebelo es el sitio de la amplificación de tránsito más grande en el cerebro en desarrollo. A continuación, presentamos un protocolo para orientar la modificación genética a esta capa en el pico de la proliferación mediante electroporación ex vivo y la cultura de las rebanadas del cerebelo a partir de embriones Día 14 embriones de pollo.

Ex Vivo Cultura de polluelo cerebelosos Rebanadas y espacialmente focalizadas Electroporación de gránulos precursores celulares

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

ex-vivo-culture-chick-cerebellar-slices-spatially-targeted

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

9.2K vistas.  King's College London.  La capa externa del gránulo del cerebelo es el sitio de la amplificación de tránsito más grande en el cerebro en desarrollo. A continuación, presentamos un protocolo para orientar la modificación genética a esta capa en el pico de la proliferación mediante electroporación ex vivo y la cultura de las rebanadas del cerebelo a partir de embriones Día 14 embriones de pollo. 

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Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

Transferencia génica eficaz en polluelo retinas para estudios de cultivo celular primario: Un<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Enfoque electroporación

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

Optimizado<em&gt; Ex-ovo</em&gt; El cultivo de embriones del polluelo a etapas avanzadas de desarrollo

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex Utero electroporación y organotípicos rebanada Cultura de ratón Hipocampo Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Ex Vivo Cultura de faríngea Arcos para el Estudio de corazón y músculo Progenitores y su nicho

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &amp;#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Stress resistance is one of the hallmarks for longevity and is known to be genetically governed. Here, we developed an unbiased high-throughput method to screen for mutations that confer stress resistance in ES cells with which to develop mouse models for longevity studies.

Enfoque genético adelante para descubrir Estrés Los genes de resistencia en ratones - Una pantalla de alto rendimiento en células madre embrionarias

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

Consecuencia del epicardio y Ensayo de Cultivo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Evaluación de la migración de células derivadas del epicardio

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

Análisis clonal de precursores de células madre hematopoyéticas embrionarias usando índice célula clasificación combinada con células endoteliales nicho cultura Co

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

Mediada por CRISPR pérdida de función análisis en gránulo cerebeloso células usando en el útero electroporación basado en la transferencia de genes

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An assay is described here to perfuse an isolated rat placenta and evaluate the maternal-to-fetal translocation of xenobiotics ex vivo. In addition, the evaluation of physiological processes such as fluid flow to the fetus and placental metabolism may be conducted with this methodology. This technique is suitable for evaluating maternal-to-fetal kinetics of pharmaceutical candidates or environmental contaminants. In contrast to current alternative approaches, this methodology allows the evaluation of the isolated maternal-fetal vasculature, with the systemic neural or immune involvement removed, allowing any observed changes in physiological function to be attributable to local factors within the isolated tissue.

Here is presented a protocol of ex vivo maternal-fetal vascular perfusion to enable the administration of a test article into maternal vasculature and to evaluate placental transfer of xenobiotic particles or pharmacological agents in addition to alterations in placental physiology.

Ex vivo perfusion de la placenta de roedores

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its permeability, thereby allowing different molecules to be introduced to the cell. In this paper, electroporation is used to introduce plasmids to ependymoglial cells, which line the ventricular zone of the adult zebrafish telencephalon. A fraction of these cells shows stem cell properties and generates new neurons in the zebrafish brain; therefore, studying their behavior is essential to determine their roles in neurogenesis and regeneration. The introduction of plasmids via electroporation enables long-term labeling and tracking of a single ependymoglial cell. Furthermore, plasmids such as Cre recombinase or Cas9 can be delivered to single ependymoglial cells, which enables gene recombination or gene editing and provides a unique opportunity to assess the cell&#8217;s autonomous gene function in a controlled, natural environment. Finally, this detailed, step-by-step electroporation protocol is used to obtain successful introduction of plasmids into a large number of single ependymoglial cells.

Presented here is an electroporation method for plasmid DNA delivery and ependymoglial cell labeling in the adult zebrafish telencephalon. This protocol is a quick and efficient method to visualize and trace individual ependymoglial cells and opens up new possibilities to apply electroporation to a broad range of genetic manipulations.

Método de electroporación para la entrega in Vivo de ADN plásmido en el telencéfalo adulto de pez cebra

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...