Comience por preparar una cantidad suficiente de mezcla de electroporación para el control y el gen de interés. Conecte la cámara de electrodos de la placa de Petri al electroporador. Luego, usando las puntas de Microloader, llene las agujas de microinyección con 8 microlitros de cada mezcla de electroporación.
Corte las puntas de las agujas antes de usarlas para lograr un flujo estable con tijeras finas. Asegúrese de quitar solo una pequeña parte de la punta, ya que una punta roma y ancha puede dañar gravemente los organoides. Bajo un microscopio, elija cinco organoides cerebrales con bordes lisos y estructuras visibles similares a ventrículos.
Luego muévalos a una placa de cultivo celular de 35 milímetros que contenga DMEM / F-12 precalentado usando una punta de pipeta cortada de 1000 microlitros. Ahora, inserte cuidadosamente la aguja a través de la pared de una estructura similar a un ventrículo e infundirla con la mezcla de electroporación hasta que esté visiblemente llena. No aplique presión excesiva sobre las estructuras similares a ventrículos para evitar el estallido.
Transfiera un organoide cerebral microinyectado a la cámara del electrodo de la placa de Petri con una pequeña cantidad de DMEM/F-12. Organice el organoide de modo que las superficies de las estructuras similares a ventrículos microinyectadas se enfrenten hacia el electrodo conectado al polo positivo del electroporador. Ahora, electropotree los organoides cerebrales uno por uno usando cinco pulsos de 80 voltios durante 50 milisegundos cada uno con un intervalo de un segundo.
Si la microinyección y la electroporación se realizaron en condiciones no estériles, mueva los organoides electroporados bajo una campana de flujo laminar a una nueva placa de cultivo celular de 35 milímetros llena de DMEM / F-12 precalentado. Luego cultive los organoides electroporados en DM con vitamina A en un agitador orbital a 55 RPM en una atmósfera humificada de 5% de dióxido de carbono y 95% de aire a 37 grados centígrados. Al día siguiente, después de la electroporación, verifique los organoides cerebrales para detectar una electroporación exitosa bajo un microscopio de fluorescencia invertida convencional.
Transfiera los organoides electroporados a un tubo de centrífuga cónica de 15 mililitros utilizando una punta de pipeta cortada de 1000 microlitros y elimine el exceso de medio. Añadir una cantidad suficiente de paraformaldehído al 4% en DPBS e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, aspirar el paraformaldehído.
Luego agregue 5 mililitros de DPBS, agite suavemente y aspire el DPBS. Guarde los organoides en DPBS a 4 grados centígrados hasta su uso posterior. Dos días después de la electroporación, las células GFP positivas se localizan casi exclusivamente en la zona ventricular y son positivas para Pax6, lo que indica que estas células son progenitores apicales o progenitores basales recién nacidos.
Después de 10 días, las células GFP positivas se localizan en las regiones basales. Estas células también son positivas para Pax6 o NeuN, lo que es indicativo de progenitores basales o neuronas, respectivamente. Se muestra la reconstrucción 3D de los organoides cerebrales electroporados para obtener una impresión de la distribución 3D de las células GFP positivas.
