Para comenzar la obtención de imágenes de células HeLa transfectadas, seleccione un tiempo de exposición suficientemente largo para los canales de fluorescencia individuales en el modo de visualización en vivo en función de los histogramas de intensidad generados por el software de imágenes. Establezca el número adecuado de planos para obtener imágenes en el eje Z. Seleccione el número adecuado de campos de vista para mostrar por pozo.
Para iniciar el análisis cuantitativo de las imágenes adquiridas, realice la corrección de fondo de todas las imágenes de todos los canales de fluorescencia. En función del tamaño de los objetos analizados, seleccione el tamaño de filtro adecuado. A continuación, comience la segmentación de la imagen creando una máscara del objeto principal basada en la relación entre la intensidad de la señal fluorescente y el fondo para el canal correspondiente a los núcleos celulares.
Cree máscaras para los subobjetos que representan BrdU y puntos de ADN mitocondrial utilizando los canales de fluorescencia apropiados para las estructuras dadas. Establezca los parámetros y mida la intensidad de los píxeles individuales dentro de cada máscara para todos los canales de fluorescencia. Para obtener las intensidades totales de fluorescencia para el BrdU o canal de ADN mitocondrial suma las intensidades de todos los subobjetos asignados a un núcleo celular dado.
Para obtener la intensidad media de fluorescencia, divida la intensidad total de fluorescencia por la suma del área de los subobjetos asignados a un núcleo celular dado. Los resultados de las imágenes se verificaron midiendo el ADN mitocondrial y los niveles de expresión génica utilizando PCR cuantitativa en tiempo real. El tratamiento con didesoxicitidina o DDC resultó en una disminución muy fuerte en los niveles de ADN mitocondrial.
Se observó un efecto más débil en el silenciamiento de la helicasa TFAM y TWINKLE, mientras que la transfección de células con ADN polimerasa gamma mitocondrial o POLG siRNA tuvo un efecto modesto sobre el número de copias de ADN mitocondrial. La cuantificación de la expresión de la helicasa TFAM y TWINKLE confirmó una reducción eficiente en su expresión de ARNm a aproximadamente 15 a 20% de los niveles de control. En POLG, la expresión de ARNm se redujo solo al 30%, lo que explica el efecto modesto inesperado sobre el número de copias de ADN mitocondrial.
