La síntesis de proteínas libres de células es una tecnología emergente en sistemas y biología sintética para la producción in vitro de proteínas. Los sistemas de síntesis de proteínas libres de células no tienen pared celular, por lo que tenemos acceso directo a metabolitos. En este protocolo, cuantificamos las mediciones absolutas de 40 metabolitos implicados en el metabolismo central del carbono y la energía, lo que nos permite caracterizar el metabolismo libre de células.
El protocolo se basa en la metástasis de los compuestos con anilina, lo que permite una mejor separación y una mayor resolución de espectrometría de masas. Además, utilizamos estándares internos con un isotópico que etiquetamos anilina, para la cuantificación absoluta de los metabolitos. Los metabolitos etiquetados coelute, que elimina los efectos de la supresión del hierro.
Permite la cuantificación precisa de los compuestos. Trabajando en una campana, combine 550 microlitros de la anilina, con 337,5 microlitros de agua de grado LC-MS. Y 112.5 microlitros de 12 molares de ácido clorhídrico en un tubo centrífugo.
Vortex bien, y almacenar la solución de seis anilina molar a pH 4.5 y cuatro grados Celsius. Para preparar una solución de seis molares de carbono-13 anilina, a pH 4,5, combine 250 miligramos de carbono-13 anilina con 132 microlitros de agua y 44 microlitros de 12 ácidos clorhídricos molares. Vórtice bien, y almacenar a cuatro grados Centígrados.
Para preparar 200 miligramos por mililitro solución EDC, disolver dos miligramos de EDC en 10 microlitros de agua para cada muestra a etiquetar. Y vórtice bien. Para preparar muestras, apagar y precipitar las proteínas en una reacción de síntesis de proteínas libres de células, añadiendo un volumen igual de hielo-frío 100%etanol a la reacción de síntesis libre de células.
Centrifugar la muestra a 12.000 veces g, durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante de la muestra a un nuevo tubo de centrífuga. Para etiquetar la muestra con solución de anilina de carbono-12, transfiera seis microlitros de la muestra a un nuevo tubo de centrífuga y lleve el volumen a 50 microlitros con agua.
Añadir 5 microlitros de 200 miligramos por mililitro de solución EDC, mezclar bien la solución de anilina de carbono-12 y transferir 5 microlitros al tubo. Vórtice la reacción con agitación suave durante dos horas a temperatura ambiente. Después de dos horas, retire los tubos de la coctelera y transfiéralos a una campana de humo.
Añadir 1,5 microlitros de trietilamina a cada reacción para detener la reacción de etiquetado de anilina y estabilizar los compuestos. Centrifugar a 13,500 veces g durante tres minutos. Y salva al sobrenadante.
Para etiquetar las normas internas con solución de anilina de carbono-13, diluya la solución de stock interno a 80 micromolares con un volumen final de 50 microlitros. Añadir cinco microlitros de la solución de EDC de 200 miligramos por mililitro, y cinco microlitros de la solución de anilina de carbono-13 bien mezclada. Vórtice la reacción con agitación suave durante dos horas a temperatura ambiente.
Después de dos horas, retire los tubos de la coctelera y agregue 1,5 microlitros de trietilamina a la reacción en una campana de humo. Centrifugar a 13.500 g durante tres minutos y guarde el sobrenadante. Para adivinar el estándar interno etiquetado, y la muestra etiquetada, mezclar 25 microlitros de cada uno en un vial de autosampler.
Y analizar por el procedimiento LC-MS. A continuación, para crear una curva estándar para metabolitos sin etiquetar, primero, diluir la solución de stock de metabolitos sin etiquetar a diferentes concentraciones, con un volumen de 50 microlitros. Añadir cinco microlitros de la solución de EDC de 200 miligramos por mililitro, y cinco microlitros de solución de anilina de carbono-12 a cada concentración.
Vórtice la reacción con agitación suave durante dos horas a temperatura ambiente. Y proceder con el tratamiento de trietilamina. Y centrífugalización antes de analizar por la LC-MS como antes.
Después de inicializar LC-MS, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, inyecte cinco microlitros de la muestra en la columna. Y adquiera las intensidades apropiadas de m sobre z ion para la muestra etiquetada con anilina de carbono-12. A continuación, vuelva a inyectar cinco microlitros de la misma muestra.
Y adquirir las intensidades de iones m sobre z para los estándares etiquetados de carbono-13 anilina. En este protocolo, se cuantificaron metabolitos que expresaban proteína fluorescente verde en una síntesis de proteínas libres de células a base de E.coli. Se detectaron y cuantificaron 40 metabolitos implicados en el metabolismo central del carbono y la energía utilizando normas internas.
Mientras que una curva estándar para cinco de los metabolitos que no fueron etiquetados con anilina también se desarrolló. Los diversos metabolitos involucrados en estas vías eran una clase de azúcares fosforilados, ácidos fosfo-carboxílicos, ácidos carboxílicos, nucleótidos y cofactores. Además, el método permitió la separación de pares de isómeros estructurales, como el fosfato de glucosa-seis, y el fosfato fructosa-seis en una sola ejecución LC-MS.
El paso más importante es etiquetar la muestra des prote proteinizada con anilina. Dado que la solución de anilina se separa, es importante trabajar de forma rápida y eficaz, manteniendo al mismo tiempo buenas prácticas de seguridad. Este método ayuda a caracterizar el metabolismo libre de células con la cuantificación de 40 metabolitos.
Pero, compuestos adicionales están en la mezcla libre de células, como aminoácidos que se pueden cuantificar. Esto ayudaría a proporcionar una mirada más completa en el metabolismo libre de células. Este método reveló que los sistemas libres de células tienen metabolismos complejos, todavía funcionando que pueden ser potencialmente explotados para una mejor eficiencia energética y rendimiento de carbono.
El protocolo se basa en etiquetar los compuestos con anilina con el uso de EDC como catalizador. Ambos reactivos son peligrosos y deben utilizarse con precaución.
