Para comenzar la preparación de la muestra, diseccione la hoja verdadera de la muestra transgénica de Arabidopsis thaliana tratada farmacológicamente con una cuchilla de afeitar afilada. Coloque la hoja verdadera en un portaobjetos de vidrio en una gota de agua con el lado abaxial hacia arriba. Cubra lentamente la hoja verdadera con un cubreobjetos sin burbujas de aire.
Para la obtención de imágenes, configure la trayectoria del haz seleccionando un láser de 514 nanómetros para la excitación de proteínas fluorescentes amarillas o YFP. Obtenga una alta calidad de imagen mediante el uso de una alta potencia láser. Active PMT o HYD y defina los umbrales de la banda de emisión superior e inferior en función del espectro del fluoróforo YFP.
Establezca una ventana de detección de 530 a 570 nanómetros para recopilar la señal YFP. Para la imagen secuencial del segundo color, haga clic en el botón Buscar y agregue un nuevo canal. En la búsqueda dos, seleccione un láser de 555 nanómetros para la proteína fluorescente roja, o excitación RFP, y establezca una ventana de detección de 570 a 630 nanómetros para recopilar la señal RFP.
Seleccione una lente central de 63X y 1,2 W en el sistema para obtener imágenes de la actividad de tráfico de la membrana subcelular dentro de las células precursoras estomáticas. Comience el formato con un tamaño de imagen de 1024 por 1024 píxeles, luego optimícelo en función del factor de zoom y la configuración del objetivo para obtener una buena resolución. A continuación, configure la velocidad del cabezal de escaneo, comenzando con una velocidad de 400 hercios, y optimícela en función de la situación específica de las muestras.
Para hacer zoom en una región de interés sin cambiar la lente del objetivo, introduzca un factor de zoom de uno y optimícelo en función de las necesidades específicas del experimento. El promedio de línea se refiere al número de veces que se escaneará cada línea X para obtener un resultado promedio. Comience con un promedio de línea 2X para obtener imágenes de los eventos de tráfico de membrana y optimícelos según sea necesario.
seleccione el modo de escaneo XYT en el modo de adquisición para habilitar la utilidad de serie temporal. A continuación, seleccione el período de espera entre los puntos de tiempo en intervalo de tiempo. Defina el número de fotogramas que se van a recopilar seleccionando fotogramas.
Utilice el modo de escaneo de pila Z con la proyección de máxima intensidad para recopilar la información tridimensional sobre el evento de tráfico de membrana dentro de toda la célula. A continuación, seleccione el modo de escaneo XYZ en el modo de adquisición y luego se podrá acceder a la utilidad Z-stack. Seleccione la opción Z ancha.
En el modo de escaneo, defina las imágenes superior e inferior de la pila Z con los botones de inicio y fin. A continuación, defina el grosor del paso Z haciendo clic en el tamaño del paso Z. Para procesar la imagen, haga clic en la pestaña de proceso principal en el software Confocal.
En la pestaña de proyectos abiertos en el extremo izquierdo, seleccione el archivo Z-stack interesado. A continuación, en la pestaña central denominada herramientas de proceso, seleccione la función de proyección. Elija el máximo en el panel desplegable del método y haga clic en el botón aplicar.
Se generará una imagen de proyección de pila Z en la pestaña de proyectos abiertos. Para generar el video a partir de las imágenes de la serie temporal, haga clic en la pestaña de archivo en el software Fiji y abra la función para abrir todas las imágenes de la serie temporal una por una en el orden correcto. Alternativamente, arrastre las imágenes a la imagen J para abrir los datos en el orden correcto.
A continuación, busque la función de pila en la pestaña de imágenes y elija las imágenes que desea apilar para generar un vídeo. Una vez hecho esto, guarde el archivo en formato avi con la velocidad de fotogramas deseada. En la hoja verdadera de plantas transgénicas de siete días de edad portadoras del promotor ERL1 ERL1 YFP, las células dispersas fueron resaltadas por la señal YFP donde ERL1 YFP marcó la membrana plasmática.
También se observaron múltiples señales punteadas, lo que sugiere que ERL1 también estaba localizada en los endosomas. RFP Ara7 destacó múltiples señales punteadas en casi todas las células, lo que indica los cuerpos multivesiculares, o MVB, en estas células. Cuando RFP Ara7 se fusionó con la señal ERL1 YFP, la mayoría de los puntuados se superpusieron, lo que sugiere que algunas moléculas ERL1 YFP fueron transportadas a los MVB.
Las series temporales de hojas verdaderas portadoras de ERL1 YFP y MVB proteína marcador RFP Ara7 mostraron que los endosomas marcados con YFP se movieron junto con RFP Ara7 dentro de las células del linaje estomático. Confirmó que ERL1 YFP estaba localizado en los cuerpos multivesiculares.
