Damos las gracias a Amanda Rychel de asistencia en el desarrollo del protocolo y el lapso de tiempo para la construcción de Pillitteri Lynn POLAR POLAR-eGFP ::. También damos las gracias a ABRC para proporcionar la pm-rb construir. Este protocolo fue desarrollado a través de un soporte de la concesión PRESTO desde Japón Ciencia y Tecnología de la Agencia. La investigación sobre POLAR también fue apoyado por la Universidad de Washington Libre Fondo de Investigación (RRF-4098) y la National Science Foundation (MCB-0855659). KMP es un NSF Graduate Research Fellow (DGE-0718124), y KUT es un investigador del HHMI-GBMF.

1. Esterilización de semillas <ol><li> Preparar la solución de esterilización de semillas: 33% lejía doméstica, 0,1% Triton X-100. </li><li> Coloque las semillas que llevan construcción deseada indicador fluorescente (s) y el genotipo (s) en el tubo de 1,7 ml y aplicar 1 ml de solución de esterilización. Incubar en Nutator durante 15 min. </li><li> En una campana estéril, utilizar una pipeta para retirar la solución de esterilización de tubo, dejando detrás de semillas. Enjuague con 1 ml de agua estéril. Repetir cuatro veces. </li><li> Incubar a 4 º C durante dos días o más. </li></ol> 2. Preparación de diapositivas Sala de prensa <ol><li> Mezclar 20 ml de solución al 0,5% de Bacto Agar (no puro agarosa) en agua en un matraz de 200 ml, y microondas hasta que se disuelve. Tenga cuidado al hervir la solución. </li><li> Enfriar la solución a alrededor de 60 ° C. </li><li> Recoger 1 ml de solución de agar con una pipeta y lentamente se aplican a la cubierta de vidrio en el interior de la cámara de diapositivas (Lab-Tek II compartimentado # 1,5 Sistema cubreobjetos alemán). Solución which está demasiado caliente o demasiado rápido puede aplicar pegamento o fundir vidrio crack. </li><li> Inmediatamente añadir un segundo ml de solución de agar. Medios de agar ahora debe cubrir completamente la parte inferior de la cámara de diapositivas. Este medio mínimo es suficiente para apoyar el desarrollo de un cotiledón planta, que contiene nutrientes almacenados, durante cuatro a cinco días por el mantenimiento de la humedad y permitiendo la difusión de gas. </li><li> Dejar enfriar en la diapositiva de sobremesa con cámara cubierta. Si matraz se cubre herméticamente, la solución puede ser guardado y se recalienta para su uso futuro. </li></ol> 3. Disección de Semillas <ol><li> Retire el tubo de semillas estériles de 4 ° C en almacenamiento. </li><li> Colocar un tejido de papel en la etapa de un microscopio de disección y humedecer con agua. Ajuste tejido para crear una superficie lisa. El tejido se utiliza para estabilizar las semillas para su disección. </li><li> Pipetear 20-30 semillas del tubo para el tejido, teniendo cuidado de colocarlos en el microscopio de disección campo de vista. </li><li> Con unas pinzas cortantes (Roboz, # 5 punta biología), Retire con cuidado la cubierta de la semilla de la planta de semillero en el interior. Tegumentos tanto exterior e interior debe ser eliminado. </li><li> Cuando la imagen del cotiledón, es beneficioso para eliminar el hipocotilo y la radícula. Los cotiledones contienen nutrientes suficientes para desarrollar durante varios días bajo este protocolo. Si está intacta, el hipocotilo se enderezará y alargar de manera espectacular, moviendo el cotiledón fuera del campo de lapso de tiempo de vista. Utilice un bisturí para cortar los cotiledones libres del hipocotilo. </li><li> Mantenga cotiledones disecados sumergidas en agua, en un microtubo o similar. </li><li> Repita 3.4-3.6 hasta que el número deseado de cotiledones se alcanza. 15-20 disecciones exitosas se recomienda antes del montaje. </li></ol> 4. Los cotiledones de montaje en la Cámara Slide <ol><li> Con un pequeño (18 mm 2) hoja de la cubierta, corte a través de los medios de agar y levantar toda la capa de base de cristal hasta la diapositiva cámara. </li><li> Pipetear diseccionaron los cotiledones con un mínimo de agua de la explotación agrícolatubo en el portaobjetos de cámara, bajo la capa de agar levantada. </li><li> Baje suavemente el agar en los cotiledones. Si el exceso de agua está presente, empapar lejos con un pañuelo de papel, con cuidado de no molestar a los cotiledones. Las muestras deben dejar de moverse con facilidad cuando monte es completa. </li><li> Coloque la tapa de la diapositiva y diapositiva cámara de movimiento para platina del microscopio. </li></ol> 5. Time lapse de imágenes <ol><li> Configurar microscopio confocal invertido a la imagen de la fluoróforo deseado (s). LSM700 parámetros utilizados para: GFP, excitación a 488 nm y recogida con un filtro pasa banda a 440-530 nm; para RFP, excitación a 555 nm y recogida con un filtro pasa banda a 570-610 nm. </li><li> Inspeccione muestras montadas por daños. Programar las posiciones de intacta, correctamente montado en el software de cotiledones microscopio. En el Zen 2009: Enfoque en un cotiledón de 20x objetivo y mover objetivo hasta el centro de la diapositiva de cámara. En Modo de Adquisición, cambiar el zoom a 0,5 y bastidor &lt;/ Em&gt; a 48x48 píxeles. Seleccione la casilla Posiciones e imagen Scan vista general ... botón debajo de posiciones, a continuación, aumentar el número de azulejos horizontales y verticales de 30-35. Cuando exploración haya terminado, haga clic en el botón Posiciones en la pestaña Dimensiones y mira lugar en cada cotiledón de observar. </li><li> Configure serie z que abarca la epidermis cotiledón de todos Zen samples.In 2009: Haga clic en la casilla Z-Stack. Seleccione cada posición en la Lista de posición y haga clic en el botón Mover a. Centrarse en el plano superior de la epidermis cotiledón y haga clic en el botón Set Primero bajo Z-Stack. Enfoque a la posición más baja en la que útilmente epidermis es visible y haga clic en el botón Set Final. Haga clic en el botón al lado de Optimal, que muestra mejor el z-rebanada de espesor, para ajustar. Comprobar cada cotiledón para confirmar que estos ajustes abarcar todas las muestras, los parámetros z no se puede ajustar para Indivposiciones iDual en Zen 2009. </li><li> Crear serie temporal con una resolución deseada y la longitud. Intervalos de 15-30 min durante tres días son eficaces para la dinámica de proteínas en la división celular epidérmica. Este intervalo se puede cambiar según sea necesario. En el Zen 2009: Haga clic en la casilla de series temporales. En series de tiempo, establezca Ciclos para el número de imágenes que desee utilizando el control deslizante o escribiendo en el campo de texto. Configurar el Intervalo a 30 y utilice el menú desplegable para seleccionar min. </li><li> Comience xyzt multi-posición de exploración. Tenga en cuenta que el número de posiciones debe ser limitada por las especificaciones de exploración; si el tiempo total de exploración es mayor que el intervalo deseado, los puntos de tiempo no será correcta. Un máximo de seis posiciones simultáneas son posibles cuando la imagen buenas prácticas agrarias y RFP en 59 z rodajas en un intervalo de 30 minutos usando nuestro sistema. En el Zen 2009: Cambio del tamaño del marco de la resolución que desee y haga clic en Start Experiment. </li></ol> 6. Edición de vídeo <ol><li> Desde el archivo de datos confocal, haga una intensidad máxima z-proyección de cada combinación de tiempo / posición y exportación como archivos de imagen en un formato sin pérdidas como TIFF. Los nombres de archivos deben estar en una serie por posición (por ejemplo, POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002, etc, no POLAR-GFP_0001_pos1) para el software para combinarlos en una película. En el Zen 2009: Copia Uso: Subconjunto en la pestaña Procesamiento de dividir posiciones en archivos separados, entonces la proyección de intensidad máxima. Por último, exportar como archivos TIFF (Archivo: Exportación, ventana completa resolución de imagen - series). </li><li> Utilice FIJI 7,8 para alinear imágenes sucesivas mediante la ejecución de la macro bUnwarpJ 9 (Plugins: Registro: bUnwarpJ). Cambiar el modo de registro a Mono. Todas las opciones avanzadas puede usar valores por defecto. Para largas secuencias de lapso de tiempo, descargar e instalar la macro &quot;Affine + Consistente registro elástico imagen 2D&quot;, que se aplicará bUnwarpJ a una serie de imágenes de forma automática, y abierto ynuestros datos con File: Import: Secuencia de imágenes para usarlo. Desmarque MOPS extracción hitos y correr. </li><li> Utilice FIJI / ImageJ o Quicktime Pro para abrir la secuencia de imágenes alineadas y guardar en el formato de vídeo deseado (AVI es una buena opción). </li></ol>

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	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Embryonic+Cell+Lineage+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans.">The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64 (1983).</li><li>Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A., Bate, M., Martinez Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3+Mitosis+and+Morphogenesis:+Point+and+Counterpoint.">Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint.</a> Development of Drosophila melanogaster. , (1993).</li><li>Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. 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Plant Physiology. 129 (2), 854 (2002).</li><li>Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Analysis+of+Cell+Division,+Cell+Growth,+and+Differentiation+at+the+Shoot+Apical+Meristem+in+Arabidopsis.">In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 16 (1), 74 (2004).</li><li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+of+Stomatal+Meristemoids+Reveals+New+Component+of+Asymmetric+Cell+Division+and+Commonalities+among+Stem+Cell+Populations+in+Arabidopsis.">Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23 (9), 3260 (2011).</li><li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36 (2004).</li><li>Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. &. #. 2. 2. 5. ;. n. c. h. e. z., Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. r. t. i. z. -., C, J., Kybic, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+and+Elastic+Registration+of+Histological+Sections+Using+Vector-Spline+Regularization.">Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization.</a> Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science. 4241, 85-95 (2006).</li><li>Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Out+of+the+Mouths+of+Plants:+The+Molecular+Basis+of+the+Evolution+and+Diversity+of+Stomatal+Development.">Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development.</a> Plant Cell. 22 (2), 296 (2010).</li><li>Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -. Y., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Time-lapse+Documentation+Using+Confocal+and+Multi-Photon+Microscopy+Reveals+the+Mechanisms+of+Invasion+into+the+Arabidopsis+Root+Vascular+System+by+Fusarium+oxysporum.">In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum.</a> Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011 (2007).</li><li>Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Analysis+of+Stem-cell+Divisions+in+the+Arabidopsis+thaliana+Root+Meristem.">Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem.</a> Plant Journal. 48, 619 (2006).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Esta técnica de lapso de tiempo confocal permite estudios longitudinales de expresión de la proteína marcado fluorescentemente y su localización en células individuales de la epidermis cotiledón Arabidopsis, que en el caso de las proteínas de cambio dinámico polar y otra es fundamental para una comprensión adecuada de su función. Previamente, el tiempo de formación de imágenes sostenida lapso ha sido utilizado para examinar la infección fúngica raíz de Arabidopsis 11 y el crec...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Bacto Agar </td><td> BD </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Una cámara de diapositivas </td><td> Nunc (Thermo Scientific) </td><td> 155360 </td><td> O de dos cámaras (155379) </td></tr><tr><td> El escaneo láser confocal microscopio </td><td> Zeiss </td><td> LSM700 </td><td> 2009 Zen software </td></tr><tr><td> 20x lente objetivo </td><td> Zeiss </td><td> 420650-9901 </td><td> NA 0.8, Plan-Apochromat </td></tr><tr><td> Microscopio de disección </td><td> Benz (Nacional) </td><td> 431TBL </td><td> Se ilumina desde abajo </td></tr><tr><td> # 5 fórceps, biología punta </td><td> Roboz Surgical Instrument </td><td> RS-4978 </td><td> Consejos muy finasson críticos </td></tr></tbody></table>

long-term, high-resolution confocal time lapse imaging of arabidopsis cotyledon epidermis during germination

Formación de imágenes in vivo de la dinámica en el comportamiento celular a lo largo de una secuencia de desarrollo puede ser una técnica potente para comprender la mecánica de los patrones de tejido. Durante el desarrollo del animal, la proliferación celular y los acontecimientos clave de patrones ocurrir muy rápidamente. Por ejemplo, en Caenorhabditis elegans todas las divisiones celulares requeridos para el cuerpo de la larva se completan dentro de seis horas después de la fertilización, con siete ciclos mitóticos 1; las mitosis dieciséis o más de la embriogénesis de Drosophila se producen en menos de 24 horas 2. En contraste, las divisiones celulares durante el desarrollo de la planta son lentos, típicamente del orden de un día 3,4,5. Esto impone un desafío único y una necesidad a largo plazo de imágenes en directo para documentar los comportamientos dinámicos de la división celular y la diferenciación de los eventos durante la organogénesis vegetal. Epidermis Arabidopsis es un excelente sistema modelo para la señalización de la investigación que el destino celular y el desarrollo de las plantas. En el cotiledón, este tejido se compone de aire y resistentes al agua del pavimento células intercaladas con estomas uniformemente distribuida, válvulas que se abren y cierran para controlar el intercambio de gases y la pérdida de agua. El espaciamiento apropiado de estos estomas es crítica para su función, y su desarrollo sigue una secuencia de división asimétrica y pasos de diferenciación celular para producir la epidermis organizada (Fig. 1). Este protocolo permite la observación de células y proteínas en la epidermis durante varios días de desarrollo. Este período de tiempo permite una documentación precisa de divisiones de células madre y la diferenciación de las células epidérmicas, incluyendo estomas y células epidérmicas pavimento. Las proteínas fluorescentes se pueden fusionar a proteínas de interés para evaluar su dinámica durante la división celular y los procesos de diferenciación. Esta técnica permite comprender la localización de una nueva proteína, POLAR 6, durante la etapa de proliferación de células de linaje-estomática en thArabidopsis e cotiledón epidermis, donde se expresa en las células anteriores eventos asimétricos de división y se desplaza a una zona característica de la célula de la corteza se produce poco antes de la división. Las imágenes pueden ser registrados y vídeo racionalizado producir fácilmente usando software de dominio público para visualizar la localización de proteínas dinámico y tipos de células a medida que cambian con el tiempo.

<html> Un conjunto de puntos de tiempo informativos obtenidos con este método se muestra en la Figura 3. Las membranas celulares están etiquetados con RFP (pm-rb) y GFP se fusiona a la proteína polar bajo su promotor nativo (POLAR :: POLAR-GFP) 6 En la escala de tiempo de 30-min, vemos divisiones celulares junto con los cambios en la localización de proteínas precede. Divisiones celulares asimétricas en forma linaje estomas con células madre como precursores de los estomas llam...

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Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Se describe un protocolo utilizando portaobjetos de cámara y los medios para inmovilizar los cotiledones de la planta para la formación de imágenes confocal de la epidermis durante varios días de desarrollo, la documentación de diferenciación estomática. Proteínas marcadas con fluoróforo se puede seguir dinámicamente por la expresión y localización subcelular, mejorar la comprensión de sus posibles funciones durante la división celular y la diferenciación de células de tipo.

A largo plazo, de alta resolución de imagen confocal Time Lapse de<em&gt; Cotiledones Arabidopsis</em&gt; Epidermis durante la germinación

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

long-term-high-resolution-confocal-time-lapse-imaging-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

13.6K vistas.  University of Washington. Se describe un protocolo utilizando portaobjetos de cámara y los medios para inmovilizar los cotiledones de la planta para la formación de imágenes confocal de la epidermis durante varios días de desarrollo, la documentación de diferenciación estomática. Proteínas marcadas con fluoróforo se puede seguir dinámicamente por la expresión y localización subcelular, mejorar la comprensión de sus posibles funciones durante la división celular y la diferenciación d...

Video: Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

A largo plazo de imágenes usando las células de mamíferos Wide-Field Microscopía

Investigación

Biología

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualización de Desarrollo Craneofacial en los SOX10: Kaede pez cebra transgénico Línea Usando Time-lapse microscopía confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories can face is the development and attainment of these methods. Observation of phenotypes in a process of interest is a typical objective of research labs studying gene function and this is often achieved through image capture. A particular process that is amenable to observation using imaging approaches is the corrective growth of a seedling root that has been displaced from alignment with the gravity vector. Imaging platforms used to measure the root gravitropic response can be expensive, relatively low in throughput, and/or labor intensive. These issues have been addressed by developing a high-throughput image capture method using inexpensive, yet high-resolution, flatbed scanners. Using this method, images can be captured every few minutes at 4,800 dpi. The current setup enables collection of 216 individual responses per day. The image data collected is of ample quality for image analysis applications.

This protocol describes a process for rapid collection of images of Arabidopsis seedlings responding to a gravity stimulus using commercially-available flatbed scanners. The method allows for inexpensive, high-volume capture of high-resolution images amenable for downstream analysis algorithms.

El uso de escáneres planos para recopilar de alta resolución de duración transcurrido Imágenes de la gravitrópica Respuesta Arabidopsis Root

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

-Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

Combina la sincronización celular mitótica y microscopia Confocal de alta resolución para estudiar el papel de las proteínas multifuncional ciclo celular durante la Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

Un método versátil para el montaje de Arabidopsis las hojas para la proyección de imagen de Time-lapse Intravital

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Etiquetado específico de nucleoides mitocondriales para microscopía de iluminación estructurada de lapso de tiempo

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, un método para montar larvas de Drosophila para imágenes de lapso de tiempo a largo plazo

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...