Dentro de un gabinete de bioseguridad, retire el tejido adiposo murino con fórceps estériles. Una vez que se elimine el exceso de PBS, transfiera el tejido a otra placa de Petri y lave dos veces durante cinco minutos cada una con 10 mililitros de solución de PBS AA. Agregue 20 mililitros de solución de colagenasa preparada en un vaso de precipitados de cristal que contenga un tejido fragmentado de un centímetro cuadrado y una barra magnética.
Incubar el vaso de precipitados sellado a 37 grados centígrados con agitación continua. Filtrar el homogeneizado a través de una abertura de acero inoxidable de 0,38 milímetros de 40 mallas Filtrar en una placa de Petri y recoger la suspensión celular en un tubo cónico estéril de 50 mililitros. Suspenda cuidadosamente la fracción vascular estromal en 20 mililitros de DMEM suplementado caliente y centrifugar la suspensión.
Después de desechar el sobrenadante, lave suavemente las células dos veces con 40 mililitros de medio DMEM no suplementado. Suspender el paladar en cinco mililitros de DMEM suplementado. Transfiera la suspensión a una botella T de 25 centímetros cuadrados e incube.
Lave las células tres veces con cinco mililitros de PBS AA caliente y dos veces con DMEM no suplementado. Para eliminar cualquier residuo celular y células no murinas, agregue cinco mililitros de DMEM suplementado fresco y caliente y cambie el medio cada tres o cuatro días. Una vez que las células alcancen 90 a 100% de confluencia, agregue un mililitro de solución tibia de tripsina EDTA a las células lavadas con DMEM.
Incubar durante cinco a siete minutos a 37 grados centígrados. Agregue cuatro mililitros de DMEM suplementado a la monocapa de celda separada y desagregue suavemente la suspensión. Suspender las células en cinco mililitros de DMEM suplementado caliente.
Después de centrifugar y desechar el sobrenadante, mezcle suavemente el pellet en un mililitro de DMEM suplementado. Tiñe las células con azul de tripano y cuéntalas en una cámara Neubauer. Células de semillas en matraces T-75.
Para asegurar la formación de colonias y una alta proliferación, observe la morfología de las células teñidas con hematoxilina y eosina bajo un microscopio óptico. La tinción de hematoxilina y eosina revela un citoplasma extenso con prolongaciones alargadas y abundantes microfilamentos intracelulares.
