Los autores agradecen al Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) y al Hospital Infantil de México, Federico Gómez (HIMFG) y al personal de Bioterio de la Coordinación de Investigación del IMSS, por el apoyo brindado para llevar a cabo este proyecto. Agradecemos al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca AOC (815290) y a Antonio Duarte Reyes por el apoyo técnico en el material audiovisual.

Todos los procedimientos experimentales se realizaron siguiendo las Directrices Mexicanas para el Cuidado de los Animales, con base en las recomendaciones de la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Animales de Laboratorio Internacional (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, México). El protocolo fue revisado, aprobado y registrado por el Comité de Ética en Investigación en Salud del Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092).
1. Extracción de tejido adiposo de ratas mediante resección quirúrgica
<ol><li>Preparar dos tubos cónicos con 20 ml de solución estéril 1x solución tamponada con fosfato antimicótico antibiótico (PBS-AA) (1x PBS, gentamicina [20 μg/ml] y anfotericina [0,5 μg/ml]) y mantener en hielo.</li>
	<li>Seleccione dos ratas Sprague Dawley macho adultas (R. norvegicus) en buen estado de salud. Asegúrese de que las ratas tengan entre 3 y 4 meses de edad y tengan un peso coporal de 350-450 g.</li>
	<li>Proceder a la sedación con 20 mg/kg de clorhidrato de xilazina, y 5 minutos después, administrar un anestésico con una dosis de 120 mg/kg de clorhidrato de ketamina por vía intraperitoneal. Lubrique ambos ojos con un ungüento oftálmico para evitar que se sequen. Luego, confirme la profundidad de la anestesia a través de la falta de reflejo pedal.</li>
	<li>Afeite y desinfecte la región abdominal e inguinal con una solución de yodo. Aplique cortinas quirúrgicas para mantener la esterilidad. Luego, haga una incisión longitudinal mediana desde el esternón hasta la región testicular.</li>
	<li>Retire el tejido adiposo que rodea tanto el epidídimo como los riñones con fórceps estériles y colóquelo en la solución 1x PBS-AA. Mantenga las muestras en hielo.</li>
	<li>Suturar la incisión cerrada si es necesario según las directrices institucionales y sacrificar a los animales con una dosis intracardíaca de 40 mg/kg de pentobarbital sódico. Una vez confirmada la muerte, deseche la canal siguiendo los procedimientos institucionales. NOTA: La muerte provoca mecanismos de señalización que afectan el inmunofenotipo, la capacidad de diferenciación y el efecto paracrino de las células mesenquimales. Por lo tanto, la recolección de tejido se realiza antes de la eutanasia. </li>
</ol>2. Aislamiento de células mesenquimales del tejido adiposo
<ol><li>Retire el tejido adiposo con pinzas estériles dentro de un gabinete de bioseguridad y colóquelo en papel de filtro estéril en una placa de Petri de 100 mm de diámetro para absorber el exceso de PBS.</li>
	<li>Transfiera el tejido adiposo a otra placa de Petri y realice tres lavados durante 5 min cada uno con 10 ml de 1x solución PBS-AA utilizando una pipeta de 10 ml.</li>
	<li>Desagregar mecánicamente el tejido en fragmentos de aproximadamente 1cm2 utilizando tijeras y un bisturí.</li>
	<li>Preparar colagenasa tipo IV (0,075%) en 20 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) no suplementado. Filtrar a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm y conservar a 37 °C.</li>
	<li>Añadir la solución de colagenasa (20 ml) preparada en el paso 2.4 en un vaso de precipitados de cristal con el tejido fragmentado y una barra magnética. Sellar el recipiente e incubar bajo agitación lenta y continua a 37 °C. NOTA: La digestión enzimática dura aproximadamente 90 min (mantener la agitación lenta para preservar la integridad de las membranas celulares).</li>
	<li>Filtrar el homogeneizado a través de un filtro de acero inoxidable, malla 40 y 0,38 mm de apertura en una placa de Petri de 100 mm y recoger la suspensión celular en un tubo cónico estéril de 50 ml.</li>
	<li>Agregue 20 ml de DMEM suplementado calentado (suero bovino fetal al 10% [FBS], 2 mM de glutamina, piruvato de sodio 2 mM, solución de aminoácidos no esenciales 100x y solución antimicótica antibiótica 100x [AA]). Suspenda cuidadosamente la fracción vascular estromal (SVE).</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular a 290 x g durante 10 min, desechar el sobrenadante con una pipeta de 25 ml y lavar suavemente las células con 40 ml de un medio DMEM no suplementado.</li>
	<li>Repita este paso. Use un nuevo tubo cónico estéril entre los pasos para arrastrar la menor cantidad de detritus celulares y grasa.</li>
	<li>Suspender el pellet en 5 ml de DMEM suplementado con una pipeta de 5 ml y transferir a un frasco T-25 cm2 . Incubar durante 24 h a 37 °C y 5% deCO2.</li>
	<li>Al día siguiente, realice tres lavados con 5 ml de PBS-AA calentado y dos lavados con DMEM no suplementado para eliminar los restos celulares y las células no adherentes. Añadir 5 ml de DMEM fresco, calentado y suplementado con una pipeta de 5 ml y cambiar el medio cada 3-4 días.</li>
</ol>3. Mantenimiento y expansión de los cultivos primarios de ASC
<ol><li>Una vez que las células alcancen 90% -100% de confluencia (8 ± 2 días), lavar dos veces con 5 ml de DMEM no suplementado. Añadir 1 ml de tripsina-2 mM ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) calentado al 0,025% e incubar durante 5-7 min a 37 °C.</li>
	<li>Cuando la monocapa celular se desprenda, agregue 4 ml de DMEM suplementado y desagregue suavemente la suspensión celular.</li>
	<li>Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml, agregue 5 ml de DMEM calentado y suplementado, y suspenda suavemente para homogeneizar.</li>
	<li>Centrifugar a 290 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y mezcle suavemente el pellet en 1 ml de DMEM suplementado. Contar las células en una cámara Neubauer después de teñir con azul de tripano.</li>
	<li>Finalmente, sembrar 2,5 x 103 células/cm2 en una proporción dividida de 1:4 en matraces T-75. Este paso asegura la formación de colonias y una alta tasa de proliferación.</li>
</ol>4. Caracterización morfológica de cultivos primarios ASC
<ol><li>Observar la morfología de los ASCs bajo microscopía invertida. NOTA: Antes de montar para la histología y la identificación de ASC, trate los cubreobjetos con una solución de gelatina al 1%. Irradiar con UV durante 15 min.<ol><li>Retire los cubreobjetos de la solución de etanol al 70% y déjelos secar durante 5 minutos.</li>
		<li>Sumerja los cubreobjetos en una solución estéril de gelatina al 1%, escurra y seque a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Coloque cada cubreobjetos en cada pocillo de una placa de 6 pocillos e irradie las placas con luz UV durante 15 minutos.</li>
		<li>Siembre una gota que contenga 25 x 103 células en el centro del pozo, espere 1 minuto y agregue 1 ml de medio DMEM suplementado. Incubar durante 96 h a 37 °C y 5%CO2.</li>
		<li>Retire el medio y realice tres lavados con 1x PBS-AA utilizando una pipeta de transferencia.</li>
		<li>Agregue 1 ml de formalina neutra al 3.5% a cada pocillo e incube durante 1 h en RT. Retire con cuidado la formalina y agregue 1 ml de etanol frío al 70% a cada pocillo.</li>
		<li>Selle la placa con parafilm hasta su uso, para evitar que se seque. NOTA: La morfología celular de las ASC también se evalúa mediante tinción de hematoxilina-eosina durante diferentes pasajes.</li>
		<li>Retire el etanol al 70% de cada pocillo e hidrate las células durante 5 minutos con agua destilada. Mientras tanto, filtre las soluciones de tinción.</li>
		<li>Retire el agua y tiñe las células bajo agitación lenta durante 15 minutos con la solución de hematoxilina de Harris.</li>
		<li>Retire la solución de tinción y realice dos lavados con 1x PBS.</li>
		<li>Manchar las células con solución de eosina bajo agitación lenta durante 1 min. Luego, retire la solución y realice dos lavados con 1x PBS.</li>
		<li>Retire con cuidado los cubreobjetos de cada pocillo y monte los portaobjetos en una gota de solución de montaje de PBS-glicerol (1:1 v/v).</li>
		<li>Coloque una línea de esmalte de uñas alrededor del cubreobjetos y observe los portaobjetos histológicos bajo el microscopio óptico.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Marcadores de expresión de ASCs por inmunofluorescencia
<ol><li>Prepare el tampón de lavado que contiene 1x PBS-0.05% Tween 20. Realizar los lavados en RT y con agitación lenta. Lave las placas tres veces con 2 ml de tampón/pocillo (incubar durante 3 minutos por cada lavado).</li>
	<li>Colocar 1 ml de reactivo bloqueador (1:10) e incubar con agitación lenta durante 20 min.</li>
	<li>Agregue 200 μL (dilución 1:50) de los siguientes anticuerpos primarios a cada pocillo: CD9 (ratón monoclonal), CD34 (conejo policlonal) y anti-CD63 (cabra policlonal). Incubar durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Lavar las placas tres veces de nuevo e incubar con 200 μL (dilución 1:50) de los siguientes anticuerpos secundarios: cabra conjugada anti ratón IgG FITCH, burro anticabra IgG DyeLight 550 y cabra anti conejo IgG Cy3.</li>
	<li>Lavar tres veces con 1x PBS-0.05% Tween 20 y contrateñir los núcleos celulares con 100 μL de DRAQ-7 (dilución: 17 μL en 1 mL de agua destilada doble) durante 20 min.</li>
	<li>Lavar tres veces más y montar las guías de acuerdo con los pasos 4.1.12-4.1.13. Guarde las muestras protegidas de la luz y congeladas hasta su uso.</li>
	<li>Visualice las muestras bajo microscopía confocal de epifluorescencia utilizando la configuración adecuada y el software recomendado para este equipo.</li>
</ol>6. Marcadores de expresión de ASCs por citometría de flujo
<ol><li>Ajustar una suspensión de una sola célula a partir de células tripsinizadas o descongeladas (subpasajes 3 o 4) a una concentración de 1 x 106 células/ml de 1x PBS-5% FBS. Alícuota 100 μL con 100.000 células en tubos centrífugos de 1,5 ml. Utilice una alícuota sin etiquetado para el control de autofluorescencia.</li>
	<li>Agregue al resto todas las cantidades apropiadas de Anti-CD105 AF-594 y Anti-CD31 AF-680, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Incubar en la oscuridad durante 20 min a 4 °C.</li>
	<li>Lavar el exceso de tinción con 1 mL de 1x PBS-5% FBS por centrifugación a 250 x g durante 5 min y suspender en 300 μL de formalina al 1%.</li>
	<li>Realizar la adquisición de muestras en un citómetro de flujo. La estrategia de compuerta de las células se basa en FSC-A vs. SSC-A gating, celdas individuales cerradas usando SSC-H vs. SSC-A seguido de FSC-A vs. FSC-H.</li>
	<li>Utilice el detector Y610-mCherry-A para CD105 AF-594 y el detector R660-APC-A para CD31 AF-680.</li>
</ol>7. Diferenciación de ASCs al linaje adipogénico
<ol><li>En una placa de 6 pocillos, sembrar 1 x 104 células (P-4) por cm2 e incubar a 37 °C, 5% CO2, hasta la confluencia del 60-80% (~72-96 h). Inducir diferenciación, aplicando directamente al medio de cultivo: 4 μM de insulina, 1 μM de dexametasona 21-acetato (Dxa) y 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (MIX). Cambiar el medio de diferenciación cada 2-3 días.</li>
	<li>Preparar una solución madre de insulina de 800 μM en 2 ml de agua ultrapura estéril (añadir 20 μL de HCl 1 N para asegurar la disolución completa) y almacenar a -20 °C. Añadir 10 μL de caldo de insulina, previamente diluido 1:100, y aplicar 10 μL a un volumen final de 2 ml por pocillo.</li>
	<li>Prepare una solución madre de 1 mM Dxa en 5 ml de agua ultrapura estéril (tenga en cuenta que no se produce una disolución completa). Conservar a 4 °C. Añadir 40 μL/pocillo de una dilución 1:4 de material Dxa.</li>
	<li>Preparar un stock de 100 mM de MIX en 2,5 ml de NaOH 0,1 N, vórtice, y añadir 40 μL de NaOH de 1 N para la disolución completa. Conservar a -70 °C. Añadir 10 μL/pocillo de material MIX.</li>
	<li>Filtrar las soluciones madre a través de un filtro de jeringa estéril de 0,22 μm antes de almacenarlas.</li>
	<li>El día 12, lavar las células tres veces con 1x PBS e incubar con 500 μL de formalina al 4 % durante 1 h en RT. Lavar cada pocillo dos veces con agua destilada seguida, al 60% de isopropanol durante 5 min y dejar secar.</li>
	<li>Añadir 0,5% de aceite rojo O diluido en isopropanol al 60% (500 μL/pocillo) e incubar durante 20 min a RT. Lavar con 1 ml de agua destilada tres veces y observar bajo un microscopio invertido. NOTA: Para los reactivos, equipos y materiales requeridos, consulte la Tabla de materiales.</li>
</ol>

Aislamiento y caracterización de células madre derivadas del tejido adiposo

<ol>
	<li>Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+\anatomic+site+and+age+on+the+replication+and+differentiation+of+rat+adipocyte+precursors+in+culture.">Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).</li><li>Greenwood, M. R., Hirsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+adipocyte+cellularity+in+the+normal+rat.">Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat.</a> Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).</li><li>Gonz&#225;lez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , (2014).</li><li>Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cell+yield+and+growth+characteristics+are+affected+by+the+tissue-harvesting+procedure.">Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure.</a> Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).</li><li>Sherman, L. S., Conde-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-free+method+for+isolation+and+expansion+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).</li><li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects.">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li><li>Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adipose+tissue-derived+stem+cells:+enzymatic+digestion+in+combination+with+mechanical+distortion+to+increase+adipose+tissue-derived+stem+cell+yield+from+human+aspirated+fat.">Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).</li><li>Gittel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+equine+multipotent+mesenchymal+stromal+cells+by+enzymatic+tissue+digestion+or+explant+technique:+comparison+of+cellular+properties.">Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties.</a> BMC Veterinary Research. 9, 221 (2013).</li><li>Aliborzi, G., Vahdati, A., Mehrabani, D., Hosseini, S. E., Tamadon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization+and+growth+kinetic+comparison+of+bone+marrow+and+adipose+tissue+mesenchymal+stem+cells+of+guinea+pig.">Isolation, characterization and growth kinetic comparison of bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells of guinea pig.</a> International Journal of Stem Cells. 9 (1), 115-123 (2016).</li><li>Jurgens, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+tissue-harvesting+site+on+yield+of+stem+cells+derived+from+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Cell and Tissue Research. 332 (3), 415-426 (2008).</li><li>Secunda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+expansion+and+characterisation+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+bone+marrow,+adipose+tissue,+umbilical+cord+blood+and+matrix:+a+comparative+study.">Isolation, expansion and characterisation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood and matrix: a comparative study.</a> Cytotechnology. 67 (5), 793-807 (2015).</li><li>Tholpady, S. S., Katz, A. J., Ogle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+from+rat+visceral+fat+exhibit+multipotential+differentiation+in+vitro.">Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro.</a> The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 272 (1), 398-402 (2003).</li><li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-assisted+lipotransfer+for+cosmetic+breast+augmentation:+supportive+use+of+adipose-derived+stem/stromal+cells.">Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 32 (1), 48-57 (2008).</li><li>Si, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells:+Sources,+potency,+and+implications+for+regenerative+therapies.">Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 114, 108765 (2019).</li><li>Hammoud, S. H., AlZaim, I., Al-Dhaheri, Y., Eid, A. H., El-Yazbi, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perirenal+adipose+tissue+inflammation:+Novel+insights+linking+metabolic+dysfunction+to+renal+diseases.">Perirenal adipose tissue inflammation: Novel insights linking metabolic dysfunction to renal diseases.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 707126 (2021).</li><li>Liu, B. X., Sun, W., Kong, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perirenal+fat:+A+unique+fat+pad+and+potential+target+for+cardiovascular+disease.">Perirenal fat: A unique fat pad and potential target for cardiovascular disease.</a> Angiology. 70 (7), 584-593 (2019).</li><li>Lee, J., Han, D. J., Kim, S. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue-derived+stem+cells+for+cell+therapy+of+airway+allergic+diseases+in+mouse.">Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse.</a> Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).</li><li>Haasters, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+immunocytochemical+characteristics+indicate+the+yield+of+early+progenitors+and+represent+a+quality+control+for+human+mesenchymal+stem+cell+culturing.">Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing.</a> Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+pig+adipose-derived+progenitor+cells.">Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells.</a> Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).</li><li>Varma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypical+and+functional+characterization+of+freshly+isolated+adipose+tissue-derived+stem+cells.">Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells.</a> Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).</li><li>Palumbo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolation,+characterization+and+expansion+of+human+adipose-derived+stem+cells+(ASCs):+An+overview.">Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).</li><li>Yu, B., Zhang, X., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+derived+from+mesenchymal+stem+cells.">Exosomes derived from mesenchymal stem cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).</li><li>Maumus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+human+adipose+stromal+cells:+localization,+morphology,+and+phenotype.">Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype.</a> International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).</li><li>Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+primary+isolation+and+culture+of+adipose-derived+stem+cells+and+their+phenotypic+profile.">A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile.</a> Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).</li><li>He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+mesenchymal+stem+cells+from+rat+bone+marrow+and+adipose+tissue.">Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue.</a> Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

En las últimas cuatro décadas desde el descubrimiento de las MSC, varios grupos de investigadores han descrito procedimientos para obtener MSCs de diferentes tejidos y especies. Una de las ventajas de utilizar ratas como modelo animal es su fácil mantenimiento y rápido desarrollo, así como la facilidad de obtención de MSCs a partir del tejido adiposo. Se han descrito diferentes fuentes tisulares para la obtención de ASCs, como grasa visceral, perirrenal, epididimaria y subcutánea 12,13,14,...

Las células madre mesenquimales (MSC) han tenido un fuerte impacto en la medicina regenerativa debido a su alta capacidad de autorrenovación, proliferación, migración y diferenciación en diferentes linajes celulares 1,2. Actualmente, una gran cantidad de investigación se centra en su potencial para el tratamiento y diagnóstico de diversas enfermedades.
Existen diferentes fuentes de células mesenquimales: médula ósea, músculo esquelético, líquido amniótico, folículos pilosos, placenta y tejido adiposo, entre otros. Se obtienen de diferentes especies, incluyendo humanos, ratones, ratas, perros y caballos3. Las MSC derivadas de médula ósea (BMSC) se han utilizado durante muchos años como una fuente importante de células madre en medicina regenerativa y como una alternativa al uso de células madre embrionarias4. Sin embargo, las MSC derivadas de tejido adiposo, o células madre derivadas de tejido adiposo (ASCs), son una alternativa importante con grandes ventajas debido a su facilidad de recolección y aislamiento, así como al rendimiento de las células obtenidas por gramo de tejido adiposo 5,6. Se ha informado que la tasa de cosecha de los ASC es generalmente más alta que la de las BMSC7. Inicialmente se propuso que la capacidad reparadora/regenerativa de las ASC se debía a su capacidad para diferenciarse en otros linajes celulares8. Sin embargo, la investigación en los últimos años ha reforzado el papel principal de los factores paracrinos liberados por las ASC en su potencial reparador 9,10.
El tejido adiposo (AT), además de ser una reserva de energía, interactúa con los sistemas endocrino, nervioso y cardiovascular. También está involucrado en el crecimiento y desarrollo postnatal, el mantenimiento de la homeostasis de los tejidos, la reparación de tejidos y la regeneración. El AT está compuesto por adipocitos, células del músculo liso vascular, células endoteliales, fibroblastos, monocitos, macrófagos, linfocitos, preadipocitos y ASC. Estos últimos poseen un papel importante en la medicina regenerativa debido a su baja inmunogenicidad11,12. Los ASC se pueden obtener por digestión enzimática y procesamiento mecánico o por explantes de tejido adiposo. Los cultivos primarios de ASC son fáciles de mantener, cultivar y expandir. La caracterización fenotípica de las ASCs es esencial para verificar la identidad de las células mediante la evaluación de la expresión de marcadores específicos de membrana utilizando métodos como la inmunofluorescencia y la citometría de flujo13. La Federación Internacional de Terapéutica y Ciencia Adiposa (IFATS) y la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT) han definido que las ASC expresan CD73, CD90 y CD105, mientras que carecen de la expresión de CD11b, CD14, CD19, CD45 y HLA-DR14. Por lo tanto, estos marcadores, tanto positivos como negativos, se consideran confiables para la caracterización de las ASC.
Este proyecto se centró en describir un procedimiento para el aislamiento e identificación de células mesenquimales adultas extraídas de TA de ratas, ya que esta fuente de células no presenta desafíos éticos, a diferencia de las células madre embrionarias. Esto solidifica el procedimiento como una opción viable debido a la facilidad de acceso y al método mínimamente invasivo en comparación con las células madre derivadas de la médula ósea. 
Las células mesenquimales de esta fuente de tejido tienen un papel importante en la medicina regenerativa debido a sus capacidades inmunomoduladoras y bajo rechazo inmune. Por lo tanto, el presente estudio es una parte fundamental de futuras investigaciones sobre su secretoma y su aplicación como terapia regenerativa en diferentes enfermedades, incluidas enfermedades metabólicas como la diabetes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30078.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>AX224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti- CD9 (C-4)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-13118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-CD34 (C-18)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-7045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-C63</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-5275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 </td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-18838A594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>Sc-18916AF680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 </td>
			<td>Novus</td>
			<td>NB 120-6939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>SA5-10087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab&#180;)</td>
			<td>RD Systems.</td>
			<td>No. F103B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Top Filter Sterile</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>10718003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell and Tissue Culture Flasks</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>170718-312B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides</td>
			<td>SIGMA Aldrich </td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell wells: 6 well with Lid</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>25810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge conical tubes</td>
			<td>HeTTICH</td>
			<td>ROTANA460R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge eppendorf tubes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>M0018242_44797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV </td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial</td>
			<td>SPL Life Science</td>
			<td>43112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One </td>
			<td>191180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytExpert 2.0</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Free version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFlex LX cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>FLOW-2463VID03.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td> 67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DraQ7 Dye</td>
			<td>Thermo Sc. </td>
			<td>D15106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin yellowish</td>
			<td>Hycel</td>
			<td>300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 96%</td>
			<td>Baker</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One </td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One </td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum </td>
			<td>CORNING</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>128111163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15750045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin-High Purity</td>
			<td>Herschi Trading </td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>AMRESCO </td>
			<td>0701-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 240i CO2 Incubator </td>
			<td>Thermo Sc.</td>
			<td>50116047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate)</td>
			<td>Aranda</td>
			<td>SV057430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine </td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc. </td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM software Zen 2009 V5.5</td>
			<td></td>
			<td>Free version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet Class II</td>
			<td>NuAire</td>
			<td>12082100801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent microscope </td>
			<td>Zeiss Axiovert 100M</td>
			<td>21.0028.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope </td>
			<td>Olympus CK40</td>
			<td>CK40-G100 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids 100X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 2 mL </td>
			<td>Sarstedt </td>
			<td>72695400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 1,5 mL</td>
			<td>Sarstedt </td>
			<td>72706400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 0.2-2 &#956;L</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td>E97743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 2-20 &#956;L</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td>F54167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 20-200 &#956;L</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td>G32419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes 100-1000 &#956;L</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td>FJ39895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen tank liquid</td>
			<td>Taylor-Wharton</td>
			<td>681-021-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>SLBC3029V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin </td>
			<td>GIBCO/ Thermo Sc. </td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish Cell culture</td>
			<td>CORNING Inc</td>
			<td>480167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>301-03-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pisabental (pentobarbital sodium)</td>
			<td>PISA Agropecuaria</td>
			<td>Q-7833-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride </td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td>2139900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1 Pipette Fillers</td>
			<td>Thermo Sc</td>
			<td>9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>L010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>L010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride </td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>15368426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td>11840-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter Sterile</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>431222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>PerkinElmer Lambda 25</td>
			<td>L6020060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titer plate shaker</td>
			<td>LAB-LINE</td>
			<td>1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipets</td>
			<td>Samco/Thermo Sc</td>
			<td>728NL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>1198566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin From Porcine Pancreas</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>102H0234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Blocking Reagent 10x</td>
			<td>BioGenex</td>
			<td>HK085-GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)</td>
			<td>Pet&#39;s Pharma</td>
			<td>Q-7972-025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and identification of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue of sprague dawley rats

Las células mesenquimales adultas han revolucionado la biología molecular y celular en las últimas décadas. Pueden diferenciarse en diferentes tipos de células especializadas, además de su gran capacidad de autorrenovación, migración y proliferación. El tejido adiposo es una de las fuentes menos invasivas y más accesibles de células mesenquimales. También se ha informado que tiene mayores rendimientos en comparación con otras fuentes, así como propiedades inmunomoduladoras superiores. Recientemente, se han publicado diferentes procedimientos para obtener células mesenquimales adultas de diferentes fuentes de tejidos y especies animales. Después de evaluar los criterios de algunos autores, estandarizamos una metodología que es aplicable a diferentes propósitos y fácilmente reproducible. Un conjunto de fracción vascular estromal (SVF) de tejido adiposo perirrenal y epididimario nos permitió desarrollar cultivos primarios con morfología y funcionalidad óptimas. Se observó que las células se adhirieron a la superficie plástica durante 24 h, y exhibieron una morfología similar a los fibroblastos, con prolongaciones y tendencia a formar colonias. Se utilizaron técnicas de citometría de flujo (CF) e inmunofluorescencia (IF) para evaluar la expresión de los marcadores de membrana CD105, CD9, CD63, CD31 y CD34. La capacidad de las células madre derivadas de tejido adiposo (ASC) para diferenciarse en el linaje adipogénico también se evaluó utilizando un cóctel de factores (insulina 4 μM, 0,5 mM 3-metil-iso-butil-xantina y 1 μM dexametasona). Después de 48 h, se observó una pérdida gradual de la morfología fibroblastoide, y a los 12 días, se confirmó la presencia de gotas lipídicas positivas a tinción de rojo aceite. En resumen, se propone un procedimiento para obtener cultivos de ASC óptimos y funcionales para su aplicación en medicina regenerativa.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have strongly impacted regenerative medicine due to their high capacity for self-renewal, proliferation, migration, and differentiation into different cell lineages1,2. Currently, a great deal of research is focusing on their potential for the treatment and diagnosis of various diseases.
There are different sources of mesenchymal cells: bone marrow, skeletal muscle, amniotic fluid, hair follicles, placenta, and adipose tissue, among others. They are obtained from different species, including humans, mice, rats, dogs, and horses3. Bone marrow-derived MSCs (BMSCs) have been used for many years as a major source of stem cells in regenerative medicine and as an alternative to the use of embryonic stem cells4. However, adipose-derived MSCs, or adipose-derived stem cells (ASCs), are an important alternative with great advantages due to their ease of collection and isolation, as well as the yield of cells obtained per gram of adipose tissue5,6. It has been reported that the harvest rate of ASCs is generally higher than that of BMSCs7. It was initially proposed that the reparative/regenerative capacity of ASCs was due to their ability to differentiate into other cell lineages8. However, research in recent years has reinforced the primary role of paracrine factors released by ASCs in their reparative potential9,10.
Adipose tissue (AT), in addition to being an energy reserve, interacts with the endocrine, nervous, and cardiovascular systems. It is also involved in postnatal growth and development, the maintenance of tissue homeostasis, tissue repair, and regeneration. The AT is composed of adipocytes, vascular smooth muscle cells, endothelial cells, fibroblasts, monocytes, macrophages, lymphocytes, preadipocytes, and ASCs. The latter possess an important role in regenerative medicine due to their low immunogenicity11,12. ASCs can be obtained by enzymatic digestion and mechanical processing or by adipose tissue explants. Primary cultures of ASCs are easy to maintain, grow, and expand. Phenotypic characterization of ASCs is essential to verify the identity of the cells by assessing the expression of specific membrane markers using methods such as immunofluorescence and flow cytometry13. The International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT) have defined that ASCs express CD73, CD90, and CD105, while lacking the expression of CD11b, CD14, CD19, CD45, and HLA-DR14. These markers, both positive and negative, are therefore considered reliable for the characterization of ASCs.
This project was focused on describing a procedure for the isolation and identification of adult mesenchymal cells extracted from rats' AT, as this source of cells does not present ethical challenges, unlike embryonic stem cells. This solidifies the procedure as a viable option because of the ease of access and minimally invasive method compared to bone marrow-derived stem cells. 
Mesenchymal cells from this tissue source have an important role in regenerative medicine because of their immunomodulatory capabilities and low immune rejection. Therefore, the present study is a fundamental part of future research into their secretome and their application as regenerative therapy in different diseases, including metabolic diseases such as diabetes.

Autor destacado: Aislamiento e identificación de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo de ratas Sprague Dawley  

Aislamiento e identificación de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo de ratas Sprague Dawley

Mesenchymal stem cells have a really broad role in cellular communication due to their paracrine function. This protocol obtains adipose-derived mesenchymal stem cells with morphological, immunophenotypical, and adequate functionality for use in studying therapies for pancreatic regeneration and diabetes. There has been increased use of cell therapies in the treatment of diabetes.These therapies include allogenic transplants of pancreatic cells, autologous stem cell-derived products of insulin-producing cells, and 3D-printed pancreatic tissue using biological inks. Most research primarily studied the secretome components and the role in the regulation of different cellular processes. New techniques like microarrays and next-generation sequencing can investigate the function of miRNAs.A challenge in this area is to achieve greater stimulation of mesenchymal cells, reaching precise molecular composition in the secretome, and directing it to the treatment of a specific conditions. We will be evaluating how an miRNAs contribute to pancreatic tissue degeneration exposed to oxidative stress. The study will involve usage of stem cells from adipose tissue.

El tejido adiposo se obtuvo de ratas adultas Sprague Dawley de 3-4 meses de edad y con un peso corporal de 401 ± 41 g (media geométrica ± DE). Un valor medio de 3,8 g de tejido adiposo epididimario y perirrenal correspondió al análisis de 15 extracciones experimentales. Después de 24 h de cultivo, las poblaciones celulares permanecieron adheridas a la superficie plástica y exhibieron una morfología heterogénea. El primer pasaje se realizó a los 8 ± 2 días, con un rendimiento de 1,4 ± 0,6 x 106 cé...

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Este protocolo describe una metodología para aislar e identificar células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (MSC) de ratas Sprague Dawley.

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Las células madre mesenquimales tienen un papel muy amplio en la comunicación celular debido a su función paracrina. Este protocolo obtiene células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo con funcionalidad morfológica, inmunofenotípica y adecuada para su uso en el estudio de terapias para la regeneración pancreática y la diabetes. Ha habido un mayor uso de terapias celulares en el tratamiento de la diabetes.Estas terapias incluyen trasplantes alogénicos de células pancreáticas, productos autólogos derivados de células madre de células productoras de insulina y tejido pancreático impreso en 3D utilizando tintas biológicas. La mayoría de las investigaciones estudiaron principalmente los componentes del secretoma y el papel en la regulación de diferentes procesos celulares. Nuevas técnicas como los microarrays y la secuenciación de próxima generación pueden investigar la función de los miRNAs.Un reto en esta área es lograr una mayor estimulación de las células mesenquimales, alcanzando una composición molecular precisa en el secretoma, y dirigiéndola al tratamiento de una condición específica. Evaluaremos cómo los miRNAs contribuyen a la degeneración del tejido pancreático expuesto al estrés oxidativo. El estudio implicará el uso de células madre del tejido adiposo.

isolation-identification-mesenchymal-stem-cells-derived-from-adipose

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

1.9K vistas.  Universidad Autónoma Metropolitana. Las células madre mesenquimales tienen un papel muy amplio en la comunicación celular debido a su función paracrina. Este protocolo obtiene células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo con funcionalidad morfológica, inmunofenotípica y adecuada para su uso en el estudio de terapias para la regeneración pancreática y la diabetes. Ha habido un mayor uso de terapias celulares en el tratamiento de la diabetes.Estas terapias incluyen trasplantes alogénicos de células pan...

Video: Autor destacado: Aislamiento e identificación de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo de ratas Sprague Dawley  

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in addition to their great capacity for self-renewal, migration, and proliferation. Adipose tissue is one of the least invasive and most accessible sources of mesenchymal cells. It has also been reported to have higher yields compared to other sources, as well as superior immunomodulatory properties. Recently, different procedures for obtaining adult mesenchymal cells from different tissue sources and animal species have been published. After evaluating the criteria of some authors, we standardized a methodology that is applicable to different purposes and easily reproducible. A pool of stromal vascular fraction (SVF) from perirenal and epididymal adipose tissue allowed us to develop primary cultures with optimal morphology and functionality. The cells were observed adhered to the plastic surface for 24 h, and exhibited a fibroblast-like morphology, with prolongations and a tendency to form colonies. Flow cytometry (FC) and immunofluorescence (IF) techniques were used to assess the expression of the membrane markers CD105, CD9, CD63, CD31, and CD34. The ability of adipose-derived stem cells (ASCs) to differentiate into the adipogenic lineage was also assessed using a cocktail of factors (4 &#181;M insulin, 0.5 mM 3-methyl-iso-butyl-xanthine, and 1 &#181;M dexamethasone). After 48 h, a gradual loss of fibroblastoid morphology was observed, and at 12 days, the presence of lipid droplets positive to oil red staining was confirmed. In summary, a procedure is proposed to obtain optimal and functional ASC cultures for application in regenerative medicine.

This protocol describes a methodology for isolating and identifying adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (MSCs) from Sprague Dawley rats.

Investigación

Biología

Murine Adipose Tissue Excision

Shave the abdominal and inguinal regions of two sedated adult male Sprague Dawley rats. Disinfect the shaved regions with an iodine solution. Make a medial longitudinal incision from the sternum to the testicular region, Using a pair of sterile forceps, remove the adipose tissue from the epididymidis and the kidneys.Place the tissue in conical tubes containing 20 milliliters of cold, sterile PBS-AA solution.

Escisión del tejido adiposo murino

Murine Adipose-Derived Mesenchymal Cell Isolation, Maintenance and Characterization

Inside a biosafety cabinet, remove the murine adipose tissue with sterile forceps. Once excess PBS is removed, transfer the tissue to another petri dish and wash twice for five minutes each with 10 milliliters of PBS AA solution. Add 20 milliliters of prepared collagenase solution into a crystal beaker containing one square centimeter sized fragmented tissue and a magnetic bar.Incubate the sealed beaker at 37 degrees Celsius with continuous agitation. Filter the homogenate through a 40-mesh 0.38-millimeter stainless steel aperture Filter on a petri dish and collect the cell suspension in a sterile 50-milliliter conical tube. Carefully suspend the stromal vascular fraction in 20 milliliters of warm supplemented DMEM and centrifuge the suspension.After discarding the supernatant, gently wash the cells twice with 40 milliliters of non-supplemented DMEM medium. Suspend the palate in five milliliters of supplemented DMEM. Transfer the suspension to a 25-square centimeter T bottle and incubate.Wash cells three times with five milliliters of warm PBS AA and twice with non-supplemented DMEM. To remove any cell debris and non-murine cells add five milliliters of fresh, warm supplemented DMEM and change the medium every three to four days. Once the cells reach 90 to 100%confluency, add one milliliter of warm trypsin EDTA solution to the DMEM washed cells.Incubate for five to seven minutes at 37 degrees Celsius. Add four milliliters of supplemented DMEM to the detached cell monolayer and gently disaggregate the suspension. Suspend the cells in five milliliters of warm supplemented DMEM.After centrifuging and discarding the supernatant, gently mix the pellet in one milliliter of supplemented DMEM. Stain the cells with trypan blue and count them in a Neubauer chamber. Seed cells in T-75 flasks.To ensure colony formation and high proliferation, observe the morphology of the hematoxylin and eosin-stained cells under an optical microscope. hematoxylin and eosin staining reveal extensive cytoplasm with elongated prolongations and abundant intracellular microfilaments.

Aislamiento, mantenimiento y caracterización de células mesenquimales derivadas de tejido adiposo murino

Immunofluorescent Detection of Adipose-Derived Stem Cell Expression Markers

Begin by washing murine adipose-derived stem cells in a six-well plate with two milliliters of wash buffer. Add one milliliter of blocking reagent after incubating and washing the cells thrice. Incubate the cells with slow agitation for 20 minutes.Add 200 microliters of the primary antibodies to each well and incubate overnight at four degrees Celsius. After washing the plates thrice as demonstrated previously, incubate with 200 microliters of the secondary antibodies. Counterstain the cell nuclei with 100 microliters of DRAQ7 for 20 minutes after washing the plates thrice.Repeat washing and mount slides. Visualize the mounted slides under epifluorescence confocal microscopy. Adipose-derived stem cells were 100%positive for CD9 surface markers in all subpassages tested.All cells expressed CD63 markers in the subpassages one, three and nine, while 49.3%of the cells expressed it in passage seven. CD34 markers were absent in passages one, seven, and nine, but visible in passage three.

Detección inmunofluorescente de marcadores de expresión de células madre derivadas de tejido adiposo

Flow Cytometric Detection of Adipose-Derived Stem Cell Expression Markers

Begin by adjusting the concentration of thawed murine adipose-derived stem cell suspension using PBS with 5%fetal bovine serum. Aliquot 100 microliters of the suspension containing 100, 000 cells into a 1.5 milliliter centrifuge tube. Add appropriate amounts of anti-CD105 AF594 and anti-CD31 AF680 as per the manufacturer's instructions.Incubate for 20 minutes in the dark at four degrees Celsius. Remove excess stain by washing with PBS/FBS and centrifuge at 250 x g for five minutes. Resuspend the cells in 300 microliters of 1%formalin.Create a dot plot graph by clicking on the polygon symbol to select the subpopulation of interest and exclude the debris areas using FSC-A versus SSC-A gating. Next, click on the polygon symbol to generate a new dot plot and exclude the duplexes and multiples cells using SSC-H versus SSC-A followed by FSC-H and FSC-A. Use Y610-mCHERRY for the AF594 and the R660 APC-A detectors for the AF680 fluorophores, respectively.Click on the quadrant symbol and set each detector's threshold for autofluorescence cells. Select samples labeled with CD105 and positive population to be shown on Q1LR. Next, choose samples labeled with CD31 and positive population to be shown on Q1LR.Immunophenotyping showed that 98.7%of the cell population was positive for CD105, while only 5.88%expressed the CD31 marker.

Detección por citometría de flujo de marcadores de expresión de células madre derivadas de tejido adiposo

Adipose-Derived Stem Cell Differentiation to the Adipogenic Lineage

Begin by seeding a six well plate with 10, 000 adipose-derived stem cells per square centimeter. Once cells become 60 to 80%confluent add the differentiation medium. On day 12, wash the cells trice with PBS and incubate them with 500 microliters of 4%formalin for one hour at room temperature.Once the cells are washed with distilled water, wash them with 60%isopropanol for five minutes and let them dry. Add 500 microliters of 0.5%oil red O staining dye diluted in 60%alcohol. After incubation at room temperature wash the wells twice with one milliliter of distilled water and observe the plate under an inverted microscope.Adipose-derived stem cells differentiated towards the adipogenic lineage showing reduced cell size and rounded shape within 48 hours. After seven days, lipid vesicles were visible, which were positive for oil red staining 12 days after differentiation.