Para comenzar, tome los hermafroditas C.Elegans adultos jóvenes sincronizados en un tubo de microcentrífuga. Agregue 200 microlitros de tampón M9, que contiene Poloxamer 188, Pluronic F127 y dos microlitros del reactivo del kit de tinción al pellet de gusano. Cubra los tubos con papel de aluminio para proteger los tintes de la luz.
Deje que la mezcla gire a 20 RPM durante una hora a temperatura ambiente. Luego gire los gusanos a 500 g durante un minuto. Después de eso, retire la solución de tinción sin alterar el pellet de gusano.
Lave los gusanos con tampón M9 tres veces y transfiéralos a una placa de agar NGM sembrada que contenga el tratamiento adecuado. Lave los gusanos de las placas en tubos de microcentrífuga nuevos con un mililitro de tampón M9. Después, fije los gusanos con formaldehído al 1% en hielo durante 30 minutos.
Y lave los gusanos con un mililitro de tampón M9 tres veces para eliminar cualquier formaldehído residual. Después de peletizar los gusanos, aspirar la cantidad máxima de sobrenadante, manteniendo el pellet intacto en 10 microlitros de M9. Luego, para preparar 2.5% de agarosa, pese 0.125 gramos de agarosa en un tubo de ensayo de vidrio de borosilicato de 10 mililitros. Agregue cinco mililitros de tampón M9 y disuelva la agarosa calentando suavemente el tubo con un mechero bunsen.
Transfiera la agarosa derretida a un baño seco a 75 grados centígrados. Agregue 100 microlitros de agarosa derretida en un vidrio de cubierta de microscopio glosser de cubierta con una punta de un mililitro. Inmediatamente, coloca otro tobogán perpendicularmente sobre la gota de agarosa formando una forma de cruz.
Después de dos minutos, separe suavemente las diapositivas empujando el vidrio de la cubierta superior dejando la almohadilla de agarosa en la diapositiva de la cubierta inferior. Transfiera los gusanos a la almohadilla de agarosa con una pipeta de vidrio Pasteur. Use una mecha hecha de una toallita de laboratorio para eliminar el exceso de líquido.
Luego cubra los gusanos con un cubreobjetos más pequeño y aplique esmalte de uñas transparente a la periferia para evitar la evaporación. Coloque la corredera en una caja oscura para protegerla de la luz. Use un microscopio confocal para obtener imágenes de los gusanos dentro de las 24 horas en las longitudes de onda apropiadas usando una lente de aumento de 60 veces.
A continuación, abra el software de imágenes y haga clic derecho en el área gris. En la ventana emergente que aparece, seleccione adquisición. Almohadilla completa Ti2.
Adquisición de ND y tablas de búsqueda. En la almohadilla completa Ti2, seleccione 60 veces y ajuste la perilla de enfoque fino del microscopio para enfocar los gusanos. A continuación, seleccione disco giratorio y elija la opción de agrupación de 16 bits-no.
Para cada filtro de fluorescencia, ajuste el tiempo de exposición a 500 milisegundos y 20 milisegundos para campo brillante. Una vez establecidos estos parámetros, seleccione ejecutar ahora y espere a que la imagen de salida se genere como un archivo ND2.
