Después de obtener imágenes del C.elegane tratado con medicamentos, abra el archivo ND en el servidor de imágenes J con el complemento de colocalización y seleccione la opción de imágenes divididas en el cuadro de diálogo. Cada archivo ND contiene planos de imagen tomados en tres longitudes de onda y luz visible. Trabaje con imágenes de campo claro, verde y rojo.
Genere duplicados de estas imágenes para mantener la imagen original intacta haciendo clic en la imagen y seleccionando duplicar o usando el método abreviado de teclado shift más D.Luego reduzca el fondo generando otro duplicado de imagen como se demostró anteriormente. Reste el fondo con un radio de rodadura de 100 y seleccione la opción crear fondo para generar una imagen con el fondo de la imagen dada. Ahora vaya a procesar, haga clic en la calculadora de imágenes y reste la primera imagen duplicada de la segunda imagen duplicada.
Utilice las imágenes resultantes para el análisis de colocalización. Para usar el complemento de colocalización, convierta las imágenes de los canales verde y rojo a ocho bits haciendo clic en imagen, seleccionando tipo, seguido de ocho bits. A continuación, haga clic en plugins y seleccione colocalización.
Para medir la colocalización de las señales mitocondriales y lisosomas, establezca la relación en 75%, el canal rojo umbral en 80.0 y el canal verde umbral en 50.0. Una imagen binaria de ocho bits que contiene puntos colocalizados y combina las tres imágenes de ocho bits en una imagen RGB se genera como salida. A continuación, concéntrese en el punto en el músculo de la pared del cuerpo de la cabeza de los gusanos seleccionando manualmente el área y creando una máscara haciendo clic en editar, seleccionar y crear máscara para seleccionar la región de interés.
Para seleccionar las partículas en la región de interés, utilice la calculadora de imágenes para seleccionar las imágenes colocalizadas de ocho bits y enmascaradas. Utilice la operación y seleccione la puncta en la región de interés generando una imagen con puncta en la región de interés. Finalmente, para analizar el área de las mitocondrias y lisosomas colocalizados, seleccione analizar, seguido de analizar partículas y medir la suma de los puntos entre 0.1625 micrómetros cuadrados y cuatro micrómetros cuadrados.
Las imágenes confocales de los músculos de la pared del cuerpo de la cabeza de los gusanos mostraron la colocalización de mitocondrias y lisosomas. VL-850 indujo una mitofagia robusta en los músculos de la pared del cuerpo de la cabeza del gusano, lo que indica un potente inductor de mitofagia. La potencia mitofagia de VL-850 fue similar a la de FCCP.
