Después de obtener imágenes de las células Hep-3B tratadas con medicamentos, abra las imágenes confocales en la imagen J con el complemento de colocalización. Abra el archivo ND en el servidor de imagen J y seleccione la opción dividir canales en el cuadro de diálogo. Trabaja con imágenes verdes y rojas.
Genere duplicados de estas imágenes para mantener la imagen original intacta haciendo clic en la imagen y seleccionando duplicar o usando el método abreviado de teclado shift plus D.To reducir el fondo, generar otro duplicado de imagen, restar el fondo con un radio de rodadura de 100 y seleccionar la opción crear fondo para generar una imagen con el fondo de imágenes dado. Luego, vaya a procesar. Haga clic en la calculadora de imágenes y reste la primera imagen duplicada de la segunda imagen duplicada.
Utilice las imágenes resultantes para el análisis de colocalización. Para usar el complemento de colocalización, convierta las imágenes de los canales verde y rojo a 8 bits haciendo clic en imagen, seleccionando tipo, seguido de 8 bits. A continuación, haga clic en plugins y seleccione colocalización.
Para medir la colocalización de las señales mitocondriales y lisosomas, establezca la relación en 75%, el canal rojo umbral en 80.0 y el canal verde umbral en 50.0. Se generará una imagen binaria de 8 bits que contiene puntos colocalizados y combina las tres imágenes de 8 bits en una imagen RGB. Convierta estas imágenes en imágenes de 8 bits.
Para obtener la región de interés de las celdas, genere una imagen que resalte el área de las celdas seleccionando la imagen de un punto colocalizado. Para seleccionar toda el área de celda, seleccione la imagen de puntos colocalizados resultante y haga clic en la imagen, ajuste el umbral y establezca el umbral para asegurarse de que toda el área de celda esté resaltada. Para analizar el área de la celda, seleccione analizar, haga clic en analizar partículas y mida todas las partículas de la imagen de cero a infinito, la configuración predeterminada para analizar partículas.
Para analizar el área de las mitocondrias y lisosomas colocalizados, seleccione la imagen colocalizada de 8 bits. A continuación, seleccione analizar. Haga clic en analizar partículas y mida la suma de puntos entre 0,1625 micrómetros cuadrados y cuatro micrómetros cuadrados.
Divida el área de las mitocondrias y lisosomas colocalizados por el área celular total para medir el punto colocalizado. Las imágenes confocales de las células Hep-3B mostraron colocalización de mitocondrias y lisosomas. VL 850 y FCCP indujeron mitofagia significativa en las células Hep-3B.
