Para comenzar, inocule Limosilactobacillus reuteri DSM20016 de caldo de glicerol en seis mililitros de caldo De Man, Rogosa, Sharpe o MRS, en un tubo de 50 mililitros. Incubar el cultivo aeróbicamente durante la noche a 37 grados centígrados en una incubadora estática. Al día siguiente, inocular cuatro mililitros del cultivo nocturno en 200 mililitros de caldo MRS.
Permita que el cultivo crezca aeróbicamente en una incubadora estática de 37 grados centígrados hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance 0.5 a 0.85. A continuación, decantar el cultivo en tubos de centrífuga de 50 mililitros y colocarlos en hielo mientras equilibra los tubos. Centrifugar el cultivo en una centrífuga preenfriada y desechar el sobrenadante.
Antes de resuspender el pellet en 50 mililitros de agua doble destilada preenfriada, repita la centrifugación dos veces. Después de la última centrifugación, resuspenda el pellet en 25 mililitros de agua destilada doble, sacarosa molar 0.5 y 10% de glicerol. Centrifugar la suspensión celular, desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en dos mililitros de agua destilada doble, sacarosa molar 0.5 y 10% de glicerol en hielo.
Alícuota la suspensión en porciones de 50 a 100 microlitros en tubos de microcentrífuga preenfriados y almacene los tubos a menos 80 grados centígrados para su uso posterior. A continuación, para la electroporación, descongele una alícuota de células electrocompetentes en hielo. Mezclar de cinco a 10 microlitros del plásmido en la alícuota descongelada evitando el pipeteo tanto como sea posible.
Transfiera la mezcla a una cubeta de electroporación de un mililitro de separación helada y electroporate a 1,25 kilovoltios, 400 ohmios y 25 microfaradios. Después de la electroporación, agregue un mililitro de caldo MRS y mezcle invirtiendo la cubeta una o dos veces. Coloque las cubetas en una incubadora estática de 37 grados centígrados durante 2,5 a tres horas para la recuperación.
A continuación, coloque toda la suspensión en varias placas de barrena MRS con la selección adecuada. Coloque las placas dentro de un recipiente hermético con una pequeña vela encendida en una bolsita generadora de atmósfera anaeróbica. Crece a 37 grados centígrados durante dos o tres días o hasta que aparezcan colonias visibles.
La electroporación de L.reuteri con mCherry2 constitutivo produciendo plásmido pTRKH3 proporciona eficiencias de transformación de aproximadamente cinco a ocho colonias por 200 microlitros plateados, independientemente de la condición de metilación del plásmido. La transformación con pNZ123 sin proteína reportera constitutiva exógena produjo eficiencias de transformación de tres veces 10 a las cuatro UFC por microgramo de ADN.
