Para comenzar, tome el cocultivo hBM-MSCs y GFP-HUVECs y lave una vez con 200 microlitros por pocillo de PBS. Agregue la solución de sustrato BCIP / NBT e incube los cultivos a 37 grados centígrados mientras monitorea periódicamente el desarrollo del color. Una vez que el color se desarrolla en condiciones no osteogénicas, se lava inmediatamente con 200 microlitros por pocillo de PBS.
Después de fijar las muestras en paraformaldehído al 4%, adquirir imágenes en color de las muestras teñidas. Para cuantificar la actividad de ALP en lisados celulares, agregue 200 microlitros por pocillo de 0.25% de tripsina-EDTA a los cultivos lavados con PBS e incubar a 37 grados centígrados. Agitar los cultivos cada 10 minutos pipeteando vigorosamente hacia arriba y hacia abajo para facilitar la digestión y controlar la morfología del cultivo con un microscopio de cultivo celular estándar.
Luego transfiera las muestras a tubos de 2 mililitros y agregue 200 microlitros de medio basal de células madre mesenquimales para inhibir la tripsina. Después de centrifundar y desechar el sobrenadante, congele los gránulos a 80 grados centígrados o continúe directamente con el siguiente paso. Descongele los gránulos celulares, agregue 500 microlitros de tampón de lisis e incube durante 30 minutos en hielo.
A continuación, centrifugar a 16, 100 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y mantener las muestras en hielo. Sin perturbar ningún residuo granulado, dispense 50 microlitros del sobrenadante en cada pocillo de una placa transparente de cultivo de tejido de 96 pocillos por duplicado. Agregue 50 microlitros del reactivo de fosfatasa alcalina preparado a los pocillos de la placa de cultivo de tejido de 96 pocillos.
Agitar el plato brevemente e incubarlo a 37 grados centígrados durante 10 minutos protegido de la luz. Detenga la reacción agregando 100 microlitros de hidróxido de sodio 1-molar usando una pipeta multicanal. Usando un lector de placas, lea la densidad óptica a 410 nanómetros.
Para la cuantificación del ADN, descongele las muestras congeladas, centrifugarlas y colóquelas en hielo. Sin perturbar ningún residuo granulado, dispense 50 microlitros del sobrenadante de lisado celular en los pocillos de una placa negra de 96 pocillos por duplicado. Agregue los estándares de ADN por duplicado.
A continuación, use una pipeta multicanal para agregar 50 microlitros del agente de tinción de ADN, luego incube y lea la intensidad de fluorescencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice los valores de la curva estándar para determinar y aplicar la conversión de los valores de intensidad medidos a las concentraciones de ADN. Finalmente, normalice los valores de fosfatasa alcalina dividiéndolos por la concentración de ADN respectiva de cada muestra.
La cuantificación de la actividad de la fosfatasa alcalina para caracterizar el potencial osteogénico de los cultivos mostró que la actividad de la fosfatasa alcalina normalizada varió mucho entre las condiciones con una tendencia de aumento de la actividad con concentraciones más altas de BMP-2 y una meseta de 100 nanogramos por mililitro. Se identificaron los niveles de actividad más bajos para la condición que contenía 50 nanogramos por mililitro FGF-2. Se observó una tinción púrpura más extensa e intensa en presencia de BMP-2 en comparación con FGF-2.
