Para comenzar, tome un tubo de hBM-MSC y granularlos por centrifugación. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en un volumen apropiado de medio basal. Luego, prepare tubos de centrífuga cónica de 50 mililitros que contengan el volumen requerido de medio basal complementado con los respectivos factores de crecimiento.
Finalmente, agregue los hBM-MSC de la solución madre a una dilución de uno a 66.67 para lograr una concentración de 1.5 veces 10 a la quinta celda por mililitro. Retire la película adhesiva de polipropileno que cubre la placa de hidrogel de 96 pocillos para sembrar la placa. Aspire cuidadosamente el tampón de almacenamiento que cubre los hidrogeles colocando la punta del aspirador contra la pared del pozo y moviéndose lentamente hacia el borde del pozo interior.
Durante la siembra, mezcle la suspensión celular periódicamente para mantener la mezcla homogénea y agregue 200 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo de la placa. Luego, mantenga los cultivos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en una atmósfera humidificada. Alternativamente, use una lavadora de placas automatizada con las boquillas de aspiración colocadas al menos a 3,8 milímetros del portador de la placa y hacia el borde del pozo y aspire el amortiguador de almacenamiento.
Sembrar la placa mezclando las células con una pipeta serológica y dispensando un número igual de células al pocillo de la placa. Monitorear el desarrollo de los cultivos por microscopía de campo claro con un objetivo de cinco veces y adquirir imágenes de referencia aproximadamente 30 minutos después de la siembra para evaluar el número de células agregadas.
