Para comenzar, tome el pellet de los GFP-HUVEC cultivados a un nivel de confluencia de 80 a 100% y resuspenda las células en un volumen apropiado de medio basal para lograr una concentración de una vez 10 a la séptima células por mililitro de solución madre. Prepare tubos de centrífuga cónica de 50 mililitros que contengan el volumen requerido de medio basal complementado con los respectivos factores de crecimiento. Añadir los GFP-HUVEC de la solución madre a una dilución de uno a 66,67 para lograr una concentración de 1,5 veces 10 a la quinta célula por microlitro.
Luego aspirar el medio de la placa que contiene el monocultivo estromal y agregar 200 microlitros por pocillo de la suspensión GFP-HUVECs preparada. Incubar a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5% en una atmósfera humidificada, cambiando el medio cada tres o cuatro días. Monitorear el desarrollo del cultivo mediante microscopía de campo claro y fluorescencia utilizando un objetivo de cinco veces.
Las diferencias entre los cultivos se pudieron observar a partir de las imágenes de campo claro y fluorescencia que muestran solo los GFP-HUVECs. Los cultivos parecían menos desarrollados sin ningún factor de crecimiento, sin embargo, se observó un desarrollo más rápido en presencia de FGF-2. En contraste, las imágenes de campo claro mostraron los cultivos más densos en presencia de BMP-2.
Sin embargo, las redes vasculares se formaron tanto en condiciones que contienen factores de crecimiento como en las redes más extensas e interconectadas se formaron con FGF-2.
