Antes de comenzar, realice el aislamiento de fibroblastos sinoviales y utilice las células no adherentes recolectadas de la placa recubierta de colágeno en este procedimiento. Siembre las células no adherentes en placas de 40 a 60 milímetros que no hayan sido recubiertas con colágeno. Cultive las células a granel durante un día a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada con un 5% de dióxido de carbono.
Para eliminar los linfocitos no adherentes, aspire el medio cultivado y luego agregue un medio de cultivo fresco. Cultive las células adherentes a granel durante una o dos semanas con cambios de medio cada dos días, manteniendo la confluencia. Luego lávese dos veces con PBS o HBSS.
Seleccione los macrófagos sinoviales tratando con tripsina al 0,05% en HBSS e incube durante tres minutos a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada con dióxido de carbono al 5%. A continuación, agregue el medio de cultivo suavemente al 0,05 % de tripsina en HBSS. Después de este paso, no vierta el medio directamente sobre las células.
Para eliminar las células desprendidas, aspire el medio cultivado y luego agregue suavemente un medio de cultivo fresco. Repita dos o tres veces y mantenga las células en la placa en medio de cultivo fresco hasta su uso. Se aislaron células similares a macrófagos de ratones hembra C57BL/6 de siete a ocho semanas de edad y se analizaron mediante RT-qPCR.
La expresión de ARNm de los marcadores panmacrófagos CD68, EMR1, ITGAM, CSF1R mostró un aislamiento rico en macrófagos del tejido de la sinovitis. Para establecer la pureza de los macrófagos, se analizaron marcadores de proteínas de superficie para macrófagos y otros tipos celulares mediante citometría de flujo. Más del 90% de las células expresaron los marcadores de macrófagos CD45, CD11b y F4/80, mientras que la expresión del marcador de neutrófilos Ly6G y el marcador de células T CD3 fue inferior al 1%
