Comience colocando las articulaciones de la rodilla del ratón disecadas en una placa de cultivo. Aspire el medio de cultivo y agregue un medio de cultivo nuevo. Repita el lavado tres o cuatro veces.
Luego, bajo un microscopio estereoscópico, disloque todas las articulaciones en el medio de cultivo tirando de ellas con pinzas de punta fina. Extirpe la tibia y tantos vasos, tendones y ligamentos como sea posible, teniendo cuidado de no romper los huesos. Prepare dos tubos de 15 mililitros por muestra.
Con unas pinzas, transfiera los huesos dislocados con tejidos blandos al primer tubo. Por cada muestra obtenida de ambas patas traseras, añadir cuatro mililitros de medio digestivo al tubo. Para recolectar células residuales y fragmentos de tejido, transfiera el medio de cultivo de la placa de disección al segundo tubo de 15 mililitros.
Centrifugar el medio a 500 G durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de retirar el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo con un mililitro de medio de digestión. Y transfiera esta solución al primer tubo de 15 mililitros para que contenga casi todo el tejido, en total cinco mililitros de medio de digestión.
Luego digiere la muestra durante 60 a 120 minutos a 37 grados centígrados agitando en un horno de hibridación. Después de la incubación, mezcle la muestra pipeteando y filtre la solución celular a través de un colador celular de 40 micras en un tubo de 50 mililitros. Agregue 10 mililitros de medio de cultivo al tubo a través del filtro de células.
Centrifugar a 300 G durante 5 minutos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular con 10 mililitros de medio de cultivo. Repita la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo con dos mililitros de medio de cultivo.
