Para comenzar la impresión 3D de las construcciones de hidrogel fotoajustable, coloque la jeringa de vidrio con la biotinta de hidrogel que contiene fibroblastos dentro del cabezal de impresión y fije los componentes del cabezal de impresión mientras se asegura de un ensamblaje firme para la impresión. Luego, usando las flechas direccionales en el software Pronterface, ajuste manual y cuidadosamente la posición de la aguja de extrusión dentro de la lechada del baño de soporte en el centro del pocillo de la placa del pocillo. Deje al menos un milímetro de lodo debajo de la punta de la aguja.
Una vez que la punta de la aguja esté colocada correctamente, presione el botón de impresión en el software Pronterface y espere a que se complete la impresión. Repita los pasos demostrados anteriormente hasta obtener el número deseado de construcciones bioimpresas. Después de la impresión, deje la placa del pocillo con las construcciones cubiertas a temperatura ambiente en el gabinete de bioseguridad durante una hora.
Esto permite que se produzca la polimerización catalizada por base con la biotinta de hidrogel fotoajustable. A continuación, coloque la placa de pocillos con las construcciones bioimpresas en 3D en una incubadora estéril a 37 grados centígrados durante 12 a 18 horas para derretir la lechada del baño de soporte. A continuación, dentro de un gabinete de bioseguridad, cambie los medios que rodean las construcciones bioimpresas.
Para ello, retire manualmente el medio y el baño de soporte de gelatina derretida de los pocillos sin alterar las construcciones. A continuación, añada un volumen adecuado de medios con bajo contenido de suero a cada pocillo. Nuevamente, 24 horas antes del punto de tiempo de endurecimiento deseado, reemplace los medios en los pocillos con medios con bajo contenido de suero suplementados con LLAP estéril de 2,2 milimolares.
En el punto de tiempo de endurecimiento deseado, retire la mitad del medio de los pocillos que se van a endurecer y coloque la placa sin la tapa bajo la luz ultravioleta o UV de un OmniCure. Encienda la luz ultravioleta con un filtro de paso de banda de 365 nanómetros para endurecer las construcciones durante cinco minutos. Una vez endurecido, retire el medio restante de estos pocillos antes de agregar nuevos medios con bajo contenido de suero a cada pocillo.
Devolver la placa a la incubadora hasta realizar el estudio de activación de fibroblastos en el momento deseado, La combinación de una biotinta ácida y una lechada de baño de soporte básico facilitó la polimerización de las construcciones bioimpresas en 3D y mantuvo las estructuras cilíndricas. La microscopía del hidrogel marcado con fluorescencia mostró poros dentro del hidrogel inducidos por micropartículas de gelatina en el baño de soporte. La microscopía confocal mostró un control espacial excesivo en 3D.
Los ensayos de viabilidad de fibroblastos revelaron que las construcciones con un grosor de pared de 300 micras y con 4 millones de células por mililitro superaron a todas las demás condiciones en todos los puntos de tiempo. La viabilidad alcanzó su punto máximo en el séptimo día, con alrededor del 91% de las células teñidas vivas, y para el día 14, el 85% todavía eran viables.
