Para el ensayo de fosfatasa alcalina y los ensayos de deposición de calcio, comience lavando los andamios derivados de manzanas sembrados con células cultivados en el medio apropiado tres veces con PBS. Fije los andamios con formalina tamponada neutra al 10% durante 30 minutos. Para el ensayo de fosfatasa alcalina, prepare la solución de tinción BCIP/NBT disolviendo una tableta de BCIP/NBT en 10 mililitros de agua desionizada.
A continuación, lavar los andamios fijos con una solución TWEEN al 0,05 % y teñir con la solución BCIP/NBT durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lave los andamios antimanchas con una solución TWEEN al 0,05 % y guárdelos en PBS. Luego, imagina los andamios manchados con una cámara digital de 12 megapíxeles.
Para el ensayo de deposición de calcio, prepare una solución de tinción de Alizarin Red S al 2% en peso por volumen. A continuación, lavar los andamios fijos con agua desionizada y teñirlos con la solución Alizarin Red S durante una hora a temperatura ambiente. Lave los andamios manchados con agua desionizada y guárdelos en PBS antes de tomar imágenes.
Imagen con una cámara digital de 12 megapíxeles. Para realizar las mediciones del módulo de Young, retire los andamios sembrados en celdas de su respectivo medio de incubación e inmediatamente pruebe las muestras utilizando un aparato de compresión uniaxial hecho a medida equipado con una celda de carga de 1,5 newtons. Comprima los andamios a una velocidad constante de tres milímetros por minuto hasta una tensión de compresión máxima del 10% de la altura del andamio.
Determine el módulo de Young a partir de la pendiente de la porción lineal de las curvas de tensión/deformación. La tinción BCIP/NBT reveló un aumento sustancial de la actividad de la fosfatasa alcalina en los andamios sembrados con células cultivados en el medio de diferenciación en comparación con los andamios sembrados con células en blanco o sin diferenciación en el medio de cultivo. Se obtuvieron resultados similares para la tinción con rojo de alizarina S, lo que indica una mayor mineralización de calcio en los andamios sembrados con células cultivados en el medio de diferenciación.
El módulo de Young de los andamios sembrados en células cultivados en medio de diferenciación fue de alrededor de 192,0 kilopascales, que fue significativamente mayor que el de los andamios sembrados en células en blanco o sin diferenciación en medio de cultivo, lo que indica una mayor rigidez.
