Para empezar, fija las extremidades de un ratón anestesiado con cinta adhesiva. Sostenga la piel del abdomen hacia arriba y corte con cuidado a lo largo de la circunferencia del tórax para exponerla por completo. Haga una pequeña incisión en la aurícula derecha con unas tijeras oftálmicas e inserte inmediatamente una aguja de perfusión calibre 22 en el vértice del ventrículo izquierdo.
A continuación, empuje de 30 a 50 mililitros de líquido de perfusión cardíaca a través de la jeringa. Después de que el líquido de salida de la aurícula derecha esté completamente claro, infunda un volumen igual de solución de PFA al 4%. Diseccionar los tejidos y órganos y fijarlos durante la noche con PFA al 4% a cuatro grados centígrados.
Para inducir la descalcificación de los tejidos. coloque el tejido cardíaco fijo en 10 mililitros de solución de EDTA en una mesa vibratoria a 37 grados centígrados. Incubar durante unos dos días y cambiar el líquido diariamente.
Coloque los huesos fijos de la calvaria en 20 mililitros de solución de Quadrol al 25% para la decoloración del tejido. Incubar en una mesa vibratoria a 37 grados centígrados durante un día y cambiar el líquido una vez. A continuación, coloque el tejido secuencialmente en una solución de butanol terciario al 30% o TB.
Luego, una solución al 50 % de TB y luego una solución al 70 % de TB para realizar el desengrasado en gradiente. Posteriormente, deshidratar las muestras y la solución de TB PEG durante seis horas en una mesa vibratoria a 37 grados centígrados. Finalmente, coloque el tejido completamente deshidratado en una solución BB PEG sobre una mesa vibratoria a 37 grados centígrados.
Después de dos a cuatro horas de incubación, el tejido se volverá transparente. El método de limpieza de tejidos PEGASOS dio como resultado tejido transparente. El tejido aclarado con tinción de EDU de montaje completo mostró que el etiquetado era eficiente y estaba bien conservado.
En el grupo control, varias células positivas para EDU se distribuyeron de forma difusa a lo largo de las suturas. Después de un día de expansión de la sutura, se observaron células proliferantes en el centro y los bordes de la sutura. A medida que la sutura se ensanchaba, el número de células proliferantes disminuía con el tiempo.
Las células marcadas en verde eran pequeñas células redondas en la médula ósea, que diferían de las células de sutura positivas para EDU.
