Las etapas de organogénesis en los embriones de ratón permanecen poco estudiadas en parte debido a la difícil visualización de las estructuras complejas del embrión. Este protocolo describe técnicas que permiten la visualización y análisis 3D y 4D de embriones de ratón durante la extensión y segmentación axial. La principal ventaja de esta técnica es que permite a los investigadores estudiar y mostrar las complejas estructuras del embrión de ratón como objetos dinámicos en 3D.
Este protocolo contiene técnicas que pueden ser utilizadas en el estudio de malformaciones congénitas que afectan a la vértebra y la médula espinal de los mamíferos, como la escoliosis. Estas técnicas también se pueden utilizar con sistemas modelo in vitro, lo que permite el estudio del desarrollo embrionario humano. Para preparar embriones de ratón entre el día embrionario 8.25 y el día embrionario 10.5 para imágenes en vivo, diseccionar los embriones en medio M2 precalentado a 37 grados centígrados.
Retire suavemente el saco vitelino con fórceps limpios y lave el embrión una vez con medio M2 fresco para eliminar la sangre y los desechos producidos durante la disección. Durante el procedimiento de imágenes en vivo, incube embriones en medio DMEM de baja glucosa suplementado con FBS definido por HyClone al 10%, L-glutamina milimolar y estreptomicina de penicilina al 1% en una cámara calentada de 37 grados Celsius y un ambiente de oxígeno al 65% con 5% de dióxido de carbono. Para preparar embriones de ratón en etapa similar para microscopía de inmunofluorescencia, en lugar de usar M2 calentado, diseccione los embriones en PBS frío y fije en paraformaldehído al 4%.
Después de realizar todo el protocolo de tinción de inmunofluorescencia de montaje como se describe en el manuscrito de texto, se puede lograr la eliminación de tejidos utilizando RapiClear. Primero, coloque los embriones en el centro de un portaobjetos de vidrio cóncavo de depresión de 75 por 25 milímetros, retire todo el PBST en el portaobjetos de depresión del microscopio y agregue 200 microlitros de solución de limpieza, luego cubra la preparación del portaobjetos con una caja. Después de 10 minutos protegidos de la luz, cuando los embriones comiencen a ser transparentes, reemplace la solución de limpieza y espere 20 minutos adicionales.
Cubra el embrión con un cubrebocas que comienza desde un lado y se mueve suavemente hacia el otro. La muestra ya está lista para la obtención de imágenes. Para la limpieza con salicilato de metilo o BABB, asegúrese de que los embriones estén completamente deshidratados en 100% de metanol y luego comience la serie de BABB y metanol con aumentos sucesivos de concentración del 20% y una incubación de 20 minutos para cada paso.
Cuando la solución BABB alcance el 100%, realice dos cambios adicionales para una solución nueva. Preparar un portaobjetos de vidrio de 20 por 60 milímetros y 1,5 para montar los embriones y evitar comprimir la muestra. Agregue espaciadores hechos de arandelas delgadas de metal.
Transfiera los embriones aclarados a los portaobjetos del microscopio con un palillo de dientes, una punta de algodón fina o una pipeta Pasteur. Luego agregue una gota de medio de montaje, cubra con otra cubierta de vidrio similar y selle con parafina derretida para estabilizar mejor la preparación para evitar burbujas. Coloque el cubrecolchas en un lado y luego deslícelo gradual y suavemente hacia los lados, agregando más medio si es necesario.
La muestra ya está lista para ser fotografiada en el microscopio. Utilice Fiji/ImageJ para reposicionar el embrión en una posición estandarizada del eje anterior-posterior y dorsal-ventral después de la toma de imágenes. Reduzca el tamaño del conjunto de datos en la imagen de Fiji, luego escale e inserte los valores de escala X, Y y Z necesarios para reducir el conjunto de datos a menos de 200 megabytes.
Asegúrese de que la opción crear nueva ventana esté marcada. Luego vaya a los complementos y abra 3D Viewer. Dentro de la ventana del Visor 3D, haga clic sobre el embrión para seleccionarlo, haciendo que aparezca un cuadro 3D rojo.
Cuando utilice este modo, controle la rotación del conjunto de datos con un mouse. Después de asegurar la posición perfecta del embrión, seleccione editar, transformar la imagen y exportar la imagen transformada en la ventana del Visor 3D. Inspeccione los diferentes planos ortogonales, luego vaya a la imagen, luego apile y seleccione vistas ortogonales.
Cuando el embrión esté posicionado correctamente, seleccione el menú de la ventana Visor 3D y, a continuación, edite, transforme y guarde la matriz de transformación en un archivo de texto con una extensión mat. Abra el archivo de texto usando Fiji/ImageJ, elimine las dos primeras líneas y vuelva a guardar. Esto crea un archivo de matriz de transformación compatible con el complemento TransformJ.
Cambie al conjunto de datos de resolución completa y realice la operación de los complementos TransformJ y TransformJ afines. En la nueva ventana, busque el archivo de matriz guardado anteriormente, seleccione la interpolación cúbica B-spline y vuelva a muestrear isotropicalmente, luego haga clic en Aceptar. Después de reposicionar correctamente el embrión, recorte la mayor parte del espacio vacío creado. Para realizar una imagen de proyección Z completa, haga clic en pilas, Proyecto Z y elija la intensidad máxima.
A continuación, dibuje el ROI mínimo que contiene todo el embrión en X e Y.Cambie a las ventanas de imagen del conjunto de datos original haciendo clic en editar, seleccionar, restaurar selección y recortar seleccionando imagen. Recorte las rebanadas al principio y al final que no intersectan los tejidos embrionarios seleccionando las pilas de imagen y apertura, haga clic en las herramientas, seleccione el removedor de rebanadas y especifique la primera y la última rebanada que desea eliminar, asegurándose de cambiar el incremento a una. Si lo desea, realice más análisis y reconstrucciones en 3D utilizando las instrucciones del manuscrito de texto.
Para realizar análisis 3D de embriones más desarrollados, diseccionar fetos embrionarios del día 18.5 en PBS frío, eliminar todas las membranas embrionarias adicionales, luego lavar los fetos varias veces en PBS fresco para eliminar la sangre y los desechos producidos durante el procedimiento de disección. Fije los fetos en 4% PFA hechos en PBS a cuatro grados Celsius durante cinco a siete días. Después de lavar el embrión varias veces en PBS, deshidrate a los fetos incubando en aumentos sucesivos del 10%10 de soluciones de metanol hasta alcanzar el 100% de metanol.
Realice cada incubación durante 25 minutos en un agitador a temperatura ambiente. A continuación, incube los fetos por separado en un agitador primero durante un día en peróxido de hidrógeno al 5% en metanol y luego en peróxido de hidrógeno al 10% en metanol durante un máximo de tres días hasta que los embriones pierdan toda la pigmentación natural. Rehidrate gradualmente los embriones en una serie inversa de metanol en agua desmineralizada con cada incubación durante 20 minutos en un agitador a temperatura ambiente, luego lave los embriones tres veces durante 30 minutos por lavado en agua desmineralizada.
Para incrustar fetos en bloques de agarosa al 1%, llene un tubo o jeringa de plástico de 50 mililitros con agarosa derretida, luego coloque al feto en la agarosa en una posición vertical y mantenga esta posición con fórceps durante la solidificación de la agarosa. Coloque el molde con el bloque a cuatro grados centígrados durante 30 minutos para que la agarosa se gelatilice completamente, luego retire el bloque de agarosa con el feto del molde y colóquelo en un recipiente con agua desmoralizada. Realice la deshidratación del feto gradualmente con aumentos del 10% en la concentración de metanol diluido en agua desmineralizada o PBS, manteniendo la muestra en concentración de metanol durante al menos 45 minutos a temperatura ambiente en un agitador hasta que se alcance el 100% de metanol.
Limpie los fetos moviéndolos a través de una solución de BABB en serie y metanol durante 2,5 horas en cada concentración con aumentos del 25% en la concentración de BABB hasta alcanzar el 100% de BABB. Reemplace la solución de BABB por una fresca todos los días hasta que el feto sea completamente transparente. Este proceso puede tardar de tres a cinco días.
Use pegamento para unir el bloque de agarosa despejado al eje motor del escáner OPT, luego ajuste la óptica para obtener una imagen de todo el feto y proceda a adquirir un conjunto de datos de proyección completo. La técnica de imagen en vivo 4D permite el análisis dinámico de la expresión del reportero LuVeLu y los embriones knockout condicionales de día 8.5 Snai1. Junto con la señal normal de LuVeLu en el mesodermo presómtico, los embriones knockout condicionales Snai1 muestran la expresión de LuVeLu en la protuberancia ectópica que surge de la raya primitiva.
Los ensayos de inmunofluorescencia de montaje completo permiten la detección de posibles NMP y reguladores clave de la diferenciación del mesodermo. Las flechas blancas y amarillas resaltan las diferencias en los embriones mutantes y de tipo salvaje. La renderización 3D de inmunotinciones de montaje completo permite una mejor comprensión del tejido o la estructura en el estudio.
En este caso, se investigó la ubicación de posibles NMP en el brote de la cola. Las reconstrucciones de tejidos en 3D también son importantes para comprender y caracterizar los defectos morfológicos en embriones de ratón. La visualización interactiva de la reconstrucción 3D también se puede construir en formatos fáciles de usar.
Por ejemplo, en un archivo PDF. Estas estructuras caudales embrionarias 3D se pueden utilizar para ilustrar el poder de los modelos 3D a un público más general y para ayudar en el estudio en la enseñanza de la elongación y segmentación axial de un vertebrado. Finalmente, la visualización 3D en toto de embriones de ratón más desarrollados es posible utilizando la técnica de microscopía OTP.
Las representaciones animadas se muestran aquí, destacando rebanadas clave de fetos embrionarios del día 18.5. Lo más importante a recordar es que el resultado debe seguir siendo una representación fiel de lo que se observa en el embrión. Los investigadores pueden usar estos métodos para ir más allá de presentar solo estática a las imágenes, sino también incluir videos, reconstrucciones tridimensionales e incluso modelos 3D interactivos de sus datos.
