Antes de congelar por inmersión las rejillas de microscopía electrónica que contienen las células, inspeccione las rejillas bajo un microscopio óptico invertido. Registre las densidades celulares en cada cuadrícula para ajustar los tiempos de transferencia durante la congelación por inmersión. Caliente de dos a tres mililitros de solución salina tamponada con fosfato o PBS en un plato vacío a 37 grados centígrados.
Para la preparación de fiduciales de oro, pipetee 50 microlitros de solución de perlas de oro coloidal de 10 nanómetros en un tubo limpio de 1,5 mililitros. Añadimos dos microlitros de albúmina sérica bovina y homogeneizamos mediante micropipeteo repetidamente. Centrifugar el tubo a 15.000 a 20.000 G durante 15 minutos.
Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el gránulo con una micropipeta. Vuelva a suspender el gránulo en 50 microlitros de PBS y vuelva a centrifugar el tubo, como se demostró anteriormente. Aspire cuatro microlitros del gránulo con una punta de 10 microlitros y transfiéralo a un tubo limpio de 1,5 mililitros.
Configure la cámara ambiental al 95% de humedad y a 30 grados centígrados. Con pinzas de cinco por 15, seleccione una rejilla y lávela con PBS. Transfiera la rejilla lavada a unas pinzas profundas.
Una vez que la rejilla esté asegurada, retire las pinzas de cinco por 15 y deslice la abrazadera en las pinzas de inmersión. Inserte la rejilla en el congelador de inmersión mientras mantiene la abrazadera segura. Agregue un microlitro de fiduciales dorados a la parte posterior de la cuadrícula.
Luego agregue de dos a tres microlitros de PBS al lado de carbono de la red. Utilice la transferencia automática para secar la parte posterior de la rejilla antes de sumergir la congelación en etano líquido. Una imagen de microscopía electrónica y luz criocorrelativa de células U2OS transfectadas reveló la presencia de células productoras de VIH.
Una imagen de criotomografía electrónica mostró múltiples partículas de VIH brotando de la membrana plasmática de las células U2OS.
