Para empezar, en el día cero, precaliente el medio de diferenciación sin suero o el medio SFD que contenga Mezcle 1 citoquina a 37 grados centígrados. Luego, bajo una campana de cultivo de tejidos estéril, agregue el medio suplementado con citocinas Mix 1 a cada pocillo de una placa de seis pocillos con repelente celular. Para preparar las células, aspire el medio de cultivo de una placa de seis pocillos que contenga células madre pluripotentes inducidas humanas o células IPS humanas.
Lávelos con DPBS y luego aspire el DPBS. Luego, agregue el reactivo de disociación a las células e incube a temperatura ambiente durante un minuto. Después de aspirar este reactivo de disociación, incubar las células durante otros tres minutos a temperatura ambiente.
A continuación, golpee la placa que contiene las células 10 veces a cada lado para separar los grupos de células. Agregue un mililitro de medio SFD precalentado Mix 1 suplementado con citocinas a las celdas por pocillo. Con una pipeta de pasto, transfiera los grupos de células de cada pocillo a un pocillo de la placa repelente celular que contiene el medio con la citocina Mix 1.
Después de introducir la placa en la incubadora, muévala hacia adelante y hacia atrás, así como de lado a lado, para dispersar el contenido de manera uniforme e incubarlo para la formación de cuerpos embrioides, o EB. Al día siguiente, agite la placa repelente de células que contiene los EB para recogerlos en el centro de los pocillos. Con una pipeta pasteur, transfiera la suspensión EB de los pocillos a un tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Espere de cinco a 10 minutos para que los EB se asienten en el fondo del tubo. Mientras tanto, lave las placas repelentes de células con agua estéril o DPBS para eliminar las células individuales o los desechos. Agregue dos mililitros de medio SFD suplementado con citocinas Mix 1 a cada pocillo de la placa.
Ahora, aspire suavemente el sobrenadante del tubo de centrífuga sin desalojar los EB. Vuelva a suspender los EB en el volumen calculado del medio SFD que contiene la citocina Mix 1. Agregue un mililitro de suspensión EB a cada pocillo de la placa repelente de celda lavada que ya contiene dos mililitros de medio.
Incube la placa después de dispersar los EB moviendo suavemente la placa como se mencionó anteriormente. Después de juntar los EB en el centro de los pocillos, agregue el quirón en el costado de cada pocillo, evitando el contacto directo con las celdas, incube los pocillos como se demostró anteriormente. En los días tres y seis de diferenciación, recopile los EB y realice los cambios de medios como se demostró anteriormente para el primer día.
Use el medio SFD suplementado con citocinas Mix 3 en el tercer día y use el medio SFD suplementado con citocinas Mix 4 el día seis. Después de recolectar y asentar los EB de la placa repelente de células en un tubo de centrífuga de 15 mililitros, como se demostró anteriormente, aspire el sobrenadante, luego agregue un mililitro de reactivo de disociación celular por pocillo de EB recolectado en el tubo para resuspender los EB. A continuación, transfiera un mililitro de esta suspensión EB a cada pocillo de la placa repelente celular lavada con agua.
Después de incubar la placa durante 10 minutos en la incubadora, utilice una pipeta P1000 para disociar los EB de cada pocillo pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo no más de 10 veces. Luego, agregue cinco mililitros de tampón de lavado por pocillo de EB disociados. Recoja las células en un tubo de centrífuga de 50 mililitros pasándolas por un colador de 40 micras.
Después de contar las células en la suspensión filtrada, centrifuga las células durante 10 minutos a 300 g. Vuelva a suspender las células en 300 microlitros de tampón de lavado pipeteando suavemente unas cuantas veces, asegurándose de que no haya grumos. Proceda a aislar las células CD34 positivas utilizando un kit de microesferas CD34 según las instrucciones del fabricante.
Los EB de buena calidad mostraron un borde definido al segundo día de la diferenciación y aparecieron claros y brillantes cuando se observaron bajo un microscopio. La presencia de áreas más oscuras indicó muerte celular dentro de los EBs. Después del tratamiento con quirón con concentraciones variables en el segundo día, la cuantificación del número de células CD34 positivas en el octavo día de diferenciación reveló la respuesta de la línea celular al tratamiento.
La citometría de flujo mostró que el enriquecimiento CD34 positivo utilizando las perlas magnéticas proporcionó alrededor del 85% de células CD34 positivas.
