Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la patogénesis de la endocarditis infecciosa y los patobiogramas a través de campos como la interacción entre bacterias, células sanguíneas y células endoteliales que recubren la musculatura. La principal ventaja de esta técnica es que los injertos de tejido podrían estar expuestos directamente a interacciones mutuas con varios objetivos, como bacterias, plaquetas y proteínas en condiciones de flujo estandarizadas. La implicación de esta técnica se extiende a nuestra terapia de endocarditis infecciosa, ya que puede desentrañar importantes interacciones moleculares y factores que impulsan la alta infecciosidad de ciertos tejidos.
Este método proporciona información sobre la patogénesis de la formación de la vegetación. También puede ser aplicable en estudios que investigan la permeabilidad vascular, la movilidad celular y la expresión de células génicas. Para comenzar el protocolo, coloque una biopsia de tejido previamente preparada de 10 milímetros de diámetro, y el mismo grosor entre un portaobjetos del microscopio y una perforación circular de ocho milímetros, y una junta de goma con la superficie interior hacia arriba, para entrar en contacto con la suspensión bacteriana.
Concéntrese en la orientación del injerto de tejido mientras se coloca en el soporte. Asegúrese de que la superficie interna del tejido ya esté expuesta a las caras del torrente sanguíneo hasta ponerse en contacto con el medio experimental. A continuación, inserte el soporte con el tejido en la hoja de la junta que está incrustada en el marco metálico inferior de la cámara.
Fije el marco de metal superior con la hoja de junta correspondiente en la parte inferior de la cámara con el soporte de tejido insertado previamente. A continuación, monte toda la cámara con ocho tornillos y tuercas de tornillo. Asegúrese de que la altura de la cámara es siempre la misma en todos los injertos mediante el uso de una pinza o regla.
A continuación, conecte la cámara de flujo con una bomba peristáltica. A continuación, conecte el depósito de líquido de 400 mililitros con los tubos. Perfunda los tejidos con suspensiones de 100 mililitros de diez a las siete unidades formadoras de colonias con etiqueta fluorescente en solución salina tamponada con fosfato con el estrés total de tres cenas por centímetro cuadrado y el caudal correspondiente de cuatro mililitros por minuto durante una hora utilizando la bomba peristáltica y el depósito bacteriano.
Recircule continuamente la suspensión bacteriana de 100 mililitros utilizando el mismo depósito de recogida. Después de la perfusión, desmonte la cámara para liberar el injerto. Lave la pieza de tejido dos veces con cuatro mililitros de PBS en una placa de 12 pozos usando un agitador orbital durante tres minutos.
Luego corte la parte interna del injerto usando un punzón de biopsia de piel con un diámetro más pequeño. Coloque cada biopsia de tejido en un tubo separado de 14 mililitros que contenga un mililitro de cloruro de sodio estéril al 0,9%. Separe las bacterias del tejido usando un baño de sonicación durante 10 minutos.
Preparar un solo tubo de 14 mililitros con 10 mililitros de cloruro de sodio estéril al 0,9% para hacer diluciones en serie de la suspensión bacteriana obtenida después de la sonicación. Etiquete el tubo número dos. Preparar tres tubos de 14 mililitros con 10 mililitros de cloruro de sodio estéril al 0,9% para diluciones en serie de la suspensión bacteriana inicial llevada al experimento de profusión.
Etiquete los tubos número tres, número cuatro y número cinco. A continuación, asegure tres placas de agar, una para la perfusión bacteriana, otra para la perfusión de control de PBS, y la tercera para la suspensión bacteriana inicial utilizada para las perfusiones. Etiquete tres sectores por placa para el experimento de tejido de la siguiente manera: 10-1, 10-3 y 10-4.
Para contar el número de unidades formadoras de colonias en la perfusión bacteriana, etiquete la placa de la siguiente manera:10-1, 10-3, 10-5 y 10-7. Vórtice los tubos que contienen la biopsia de tejido durante 15 segundos cada uno, para hacer diluciones en serie. Para preparar las diluciones en serie, transfiera 100 microlitros del tubo número uno al tubo número dos, y vórtice el tubo para mezclar a fondo la solución.
Extienda 100 microlitros del contenido del tubo número uno y el número dos en los sectores correspondientes, 10-1 y 10-3 de la placa de agar. A continuación, esparza 10 microlitros del tubo número dos en el sector 10 cuatro. Repita este paso cuatro veces para obtener cuatro crecimientos separados de cada volumen de 10 microlitros.
Para preparar las diluciones en serie del cultivo inicial, primero vórtice la dilución durante 15 segundos y transfiera 100 microlitros de suspensión bacteriana al tubo número tres, y mezcle vigorosamente por vórtice. Agregue 100 microlitros del tubo número tres al tubo número cuatro y mezcle de nuevo. Repita el procedimiento para el tubo número cinco del tubo número cuatro.
Extienda 100 microlitros del contenido de los tubos número tres, el número cuatro, el número cinco, y el cultivo inicial etiquetado respectivamente en los sectores 10-3, 10-5, 10-7 y 10-1 de la placa de agar de sangre. Deje que las placas de agar de sangre debajo de la capucha laminar sequen al aire las propagaciones bacterianas, por lo general durante 10 minutos. Después, coloque las placas a 37 grados centígrados para la incubación durante la noche.
Después de la incubación durante la noche, cuente las colonias bacterianas para obtener el número de UFC. En condiciones de estrés total, se observó un apego bacteriano similar a través de los diversos tejidos del injerto para la infección por estafilococo aureus y estafiloco epidermidis. Siguiendo los procedimientos, el estreptococo sanguinis mostró una reducción significativa de la adherencia a la pared de la vena yugular bovina, en comparación con el parche de pericardio bovino.
Al comparar las tres especies de bacterias, streptococcus sanguinis presenta una adhesión significativamente menor a la pared de la vena yugular bovina en relación con staphylococcus aureus y staphylococcus epidermidis. Al intentar este procedimiento, es importante recordar haber preparado los tejidos correctos de la misma cabeza. Garantizará condiciones similares en todas las muestras de experimentos y minimizará la variabilidad de los datos entre diferentes series de experimentos.
Después de su desarrollo, esta técnica permite a los investigadores explorar los complejos sistemas de trastornos de una manera paso a paso mediante el enriquecimiento de sus enfoques modelo in vitro con diferentes elementos para construir una complejidad completa cerca del estado médico.
